Menu1

Nowoczesne metody badawcze

Magnetyczny rezonans jądrowy NMR

O Magnetycznym Rezonansie Jądrowym, potocznie zwanym NMR od angielskiego Nuclear Magnetic Resonance, napisano już wiele książek, artykułów i innych publikacji fachowych. Choć jest to dziedzina stosunkowo młoda, rozwija się bardzo dynamicznie, a jej znaczenie w chemii, biologii, medycynie i fizyce stale wzrasta. Ponieważ jest ona tak szeroka, wiec nawet nie będę próbował napisać o niej wszystkiego, ani nawet wszystkiego co najważniejsze. Artykuł ten będzie próbą zainteresowania Czytelnika problemem, przedstawieniem Mu w maksymalnym skrócie i bardzo prostych słowach (będę czasem posuwał się wiec do daleko idących uproszczeń - dla ludzi znających temat wręcz niewybaczalnych) podstaw zjawiska i jego najprostszych zastosowań. Postaram się też zasygnalizować w nim, że mogą się pojawić zastosowania poważniejsze, a także opisze całkiem przyziemne na pierwszy rzut oka problemy związane z tymi zastosowaniami.

Zjawisko NMR

Aby dowiedzieć się, dlaczego właśnie NMR jest taki ważny we współczesnej nauce i dlaczego ma takie szerokie zastosowanie w prawie wszystkich dziedzinach wiedzy badających w jakiś sposób przyrodę lub zajmujących się zachodzącymi w niej procesami, trzeba najpierw poznać samo zjawisko rezonansu.

Każdy z Czytelników z pewnością widział kiedyś zwykły kompas. Jego główną częścią jest magnes w postaci cienkiej igły zawieszonej na nici lub podpartej w środku ciężkości jakimś bolcem. Magnes taki ma te przedziwną właściwość, że gdy umieści się go w polu magnetycznym (np. w polu magnetycznym Ziemi), to choćby nie wiem jak kręcić obudową, namagnesowana igła zawsze będzie wskazywać ten sam kierunek. Będzie to kierunek zgodny z tzw. liniami sił pola. Ponieważ wiadomo ogólnie, że wiele procesów zachodzących w przyrodzie prowadzi do zmniejszenia energii zawartej w układzie w którym dany proces zachodzi, więc można przypuszczać, że i w tym przypadku minimum energii układu magnes-pole magnetyczne przypada na ustawienie igły kompasu równolegle do linii sił pola. Czy jest to jednak jedyne możliwe stabilne ustawienie igły magnesu w polu magnetycznym? Otóż, rozważając czysto teoretycznie, można sobie wyobrazić jeszcze drugie możliwe ustawienie - mianowicie antyrownoległe. W takim ustawieniu siły pola magnetycznego działające na igłę w obie strony będą się równoważyć, a igła pozostanie w bezruchu, aż do chwili gdy jakaś niewielka siła nie wytrąci jej z równowagi. Wtedy siły pola magnetycznego na nią działające przestaną się równoważyć i przeprowadzają w położenie równolegle do linii sił pola - o najniższej energii. Położenie antyrównoległe igły nazywamy metastabilnym.
Otóż okazuje się, ze jądra niektórych pierwiastków posiadają pewne właściwości magnetyczne - mocno rzecz upraszczając można powiedzieć, że są właśnie małymi magnesikami. Gdy więc taki szczególny typ jąder umieścimy w polu magnetycznym, to magnesiki analogicznie do igły kompasu ustawią się zgodnie z liniami sił pola w położeniu o najniższej energii.
Rys. 1. Magnes w polu magnetycznym

Gdy igłę naszego kompasu czymś się poruszy (dostarczy się jej energii) to zostanie ona wyprowadzona z położenia równowagi i zacznie wirować. Istnieje pewna określona ilość energii, po dostarczeniu której igła zatrzyma się dokładnie w położeniu metastabilnym. Energia ta zostanie wtedy trwale zmagazynowana przez układ i jej oddanie nastąpi dopiero wtedy, gdy znów w jakiś sposób podziałamy na igłę. Sytuacja (znów rzecz mocno upraszczając) jest podobna jeśli chodzi o jądra o własnościach magnetycznych. Otóż okazuje się, ze jeśli takie jądro umieścić w polu magnetycznym i naświetlać je promieniowaniem elektromagnetycznym, to dla pewnej ściśle określonej energii tego promieniowania (ściśle określonej długości fali i ściśle określonej częstości) nastąpi zjawisko absorpcji (pochłonięcia energii). Częstość ta zależy od rodzaju naświetlanego jądra, natężenia pola magnetycznego w którym to jądro umieściliśmy i (co dla chemika najważniejsze) w pewnym (choć niewielkim) stopniu od otoczenia tego jądra. Zjawisko absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w opisanych wyżej warunkach nazywamy właśnie Jądrowym rezonansem magnetycznym.

Historia NMR

Teoretycy przewidzieli zjawisko NMR już dość wcześnie, bo tuż po I Wojnie Światowej. Ze względu jednak na kłopoty techniczne (o czym później) doświadczalnego potwierdzenia tych przewidywań dokonano dopiero tuż po II Wojnie Światowej. Uczyniły to w 1945 r. równocześnie dwie grupy uczonych: z Uniwersytetu Stanfort i z Uniwersytetu Harvard. Rezonansem początkowo zajmowali się głównie fizycy, jednak z momentem odkrycia przesunięcia chemicznego (patrz niżej) - rok 1950 - stał on się domeną chemików. W roku 1953 amerykańska firma VARIAN wyprodukowała pierwsze komercyjne urządzenie służące do wykonywania widm tzw. rezonansu magnetycznego o wysokiej zdolności rozdzielczej zwane spektrometrem NMR. Rok 1966 to data przełomowa dla NMR - profesor Ernst ulepsza metodę detekcji sygnału NMR wykorzystując matematyczną operację zwaną transformacją Fouriera (dostał za to Nagrodę Nobla w 1991 r.).

NMR o wysokiej zdolności rozdzielczej

Cześć poświęconą rezonansowi magnetycznemu o wysokiej zdolności rozdzielczej (tzw. High Resolution NMR) muszę rozpocząć od pewnej uwagi. Otóż nasze "mikromagnesiki" jakimi są niektóre jądra, w polu magnetycznym ustawiają się zarówno równolegle do linii pola (co nas nie dziwi - bo tak właśnie zachowuje się igła magnetyczna w kompasie) jak i antyrownolegle - co jest trudniejsze do wytłumaczenia, ale do zrozumienia dalszej części dyskusji jaką prowadzę wystarczy sama znajomość tego faktu. Oba ustawienia różnią się tylko nieznacznie energią i dlatego tylko niewiele więcej jąder jest ustawionych równolegle, niż antyrownolegle do linii pola magnetycznego. Stosunek ilości "magnesików jądrowych" ustawionych równolegle do ustawionych antyrownolegle do linii pola zależy od rodzaju jądra (bardzo), natężenia pola magnetycznego (tez bardzo) i od temperatury (niewiele).
Tabela. Jądra najczęściej wykorzystywane w NMR
Jądro / Czułość względem 1H
1H / 1,00
13C / 6,31*10-4
15N / 3,85*10-6 		19F / 0,83
29Si / 3,69*10-4
31P / 6,63*10-2

Aby Czytelnik nie pszeszedł nad tym faktem zbyt łatwo do porządku dziennego mogę podać, że w temperaturze 25oC i w polu o indukcji jednej tesli (1T) na każde dziesięć milionów jąder wodoru ustawionych równolegle do linii pola przypadają 9999932 jądra ustawione antyrownolegle. Otóż okazuje się, że podczas naświetlania próbki fala elektromagnetyczna, energię może absorbować tylko ta "różnica", a więc z całkowitej liczby dwudziestu milionów jąder tylko 68 z nich. Teraz już prawdopodobnie Czytelnik rozumie dlaczego doświadczalnego potwierdzenia zjawiska rezonansu dokonano dopiero w 25 lat po jego teoretycznym odkryciu - po prostu potrzeba do tego aparatury o niewyobrażalnej wręcz czułości.
Pierwszym krokiem na drodze do NMR o wysokiej zdolności rozdzielczej było odkrycie tzw. przesunięcia chemicznego. Co to takiego? Otóż wydawałoby się, że wszystkie jądra tego samego izotopu jednego pierwiastka powinny w jednorodnym polu magnetycznym dawać rezonans przy takiej samej częstości fali elektromagnetycznej (jednakowej energii). Twierdzenie takie byłoby słuszne jednak tylko w przypadku jąder pozbawionych elektronów. Musimy sobie bowiem zdawać sprawę, że elektrony krążące wokół jądra również oddziaływują z polem magnetycznym zmieniając je "zanim dotrze do jądra". Zjawisko to nazywamy ekranowaniem jąder przez elektrony. Zatem pole magnetyczne odczuwane przez jądro nie jest polem równym co do wartości polu zewnętrznemu, lecz jest troszeczkę zmodyfikowane przez najbliższe otoczenie elektronowe. Ponieważ gęstość elektronowa wokół jądra jest zależna np. od elektroujemności atomów z nim sąsiadujacych, wiec każdy atom w cząsteczce który ma otoczenie inne niż pozostałe atomy tego samego pierwiastka, odczuwa pole magnetyczne również nieco inaczej. Jest ono nieco inaczej modyfikowane przez jego elektrony. Modyfikacje zewnętrznego pola magnetycznego przez elektrony są jednak bardzo niewielkie. Jeżeli np. jądro wodoru 1H daje rezonans w polu o indukcji 2,35T przy częstości fali elektromagnetycznej około 100 000 000 Hz (100MHz), to zjawisko ekranowania jądra może tę częstość zmienić najwyżej o 2000 Hz. Jednak dla magnesu o polu 4,70T (częstość rezonansu jąder 1H 200 MHz) ekranowanie jest dwukrotnie większe i może osiągnąć nawet 4000 Hz. Aby uniknąć problemu z precyzyjną standaryzacją magnesów wprowadzono tzw. skale p.p.m. - po prostu wybiera się wzorzec chemiczny, i różnice (podaną w hercach) pomiędzy częstością absorpcji jądra badanego i jądra w cząsteczce wzorca dzieli się przez bezwzględną częstość absorpcji wzorca:
delta= Vwzorc - Vbadane
Vwzorc
Tak zdefiniowana wartość delta zwana jest przesunięciem chemicznym, podawana jest w p.p.m. (części na milion) i nie zależy od wielkości pola generowanego przez magnes. Tu chciałbym znów zwrócić uwagę czytelników. Współczesna technika pozwala odróżnić jądra 1H o różnicy w absorpcji równej 01 Hz przy częstości bezwzględnej dochodzącej w niektórych magnesach nawet do 750 MHz. To jest tak, jakbyśmy zmierzyli odległość 7500 km z dokładnością co do jednego milimetra. Czyż nie jest to godne podziwu?
Dokonajmy jednak jeszcze jednego spostrzeżenia. Skoro w jednej cząsteczce mamy wiele jąder będących magnesikami, z których każdy wytwarza własne pole magnetyczne, to nie ma żadnego powodu, dla którego badane jądro nie miało by odczuwać pola magnetycznego sąsiadów. Pole to doda się lub odejmie od pola zewnętrznego, zależnie od tego czy sąsiad jest akurat ustawiony równolegle, czy antyrownolegle w stosunku do pola zewnętrznego. Tak więc jądro, które w jakiejś cząsteczce ma jednego sąsiada da nie jeden sygnał, lecz dwa - ponieważ w połowie cząsteczek znajdujących się w makroskopowej próbce sąsiedzi ustawieni są równolegle do pola, a w drugiej połowie antyrownolegle. Takie wzajemne oddziaływanie magnesikow nazywamy sprzężeniem spinowo-spinowym. Tu właśnie tkwi bogactwo NMR i jego największe możliwości. Za pomocą przesunięcia chemicznego możemy z łatwością powiedzieć czy badany proton pochodzi z grupy aldehydowej, pierścienia aromatycznego czy łańcucha alifatycznego. Natomiast sprzężenie spinowo-spinowe od razu udzieli nam informacji ilu i jakich sąsiadów ma dane jądro w cząsteczce. Idealna metoda analityczna.

Tabela: Przybliżone przesunięcia chemiczne rożnych grup
funkcyjnych w widmach 1Hi13C względem TMS ((CH3)4Si):
Tabela 2: Przybliżone przesunięcia chemiczne rożnych grup
funkcyjnych w widmach 1Hi13C względem TMS ((CH3)4Si):
Grupa 1H 13C Grupa 1H 13C
CH3 0-2 10-20 OH b.różne ---
CH2 1-3 15-30 CHO
(aldehydy)		 10-13 200-220
CH
(tzw.aromatyczne)		 7-8 125-130 CN --- 120-130

Rys. 2. Widmo protonowe propionitrylu CH3CH2CN wykonane przy niskiej zdolności rozdzielczej (po stronie lewej) oraz przy wysokiej zdolności rozdzielczej (strona prawa). Na widmie po lewej widoczne jest tylko przesunięcie chemiczne protonów grupy CH2 oraz grupy CH3, natomiast po prawej widoczne są również sprzężenia spinowo-spinowe - grupa CH3 jest trypletem (rozszczepiana przez dwa protony grupy CH2), a grupa CH2 jest kwartetem (rozszczepiana przez trzy protony grupy CH3). Wysokość linii biegnącej ponad sygnałami jest proporcjonalna do ich intensywności - tryplet ma wiec intensywność 3, a kwartet ma intensywność 2. Doświadczony badacz już na pierwszy rzut oka rozpozna w takim układzie pasm przejaw obecności grupy etylenowej.

Trochę o aparaturze i technice

Rys. 3. Widmo korelacyjne mentolu. Na osi poziomej znajduje się tradycyjne widmo protonowe. Jak łatwo spostrzec, odczytanie go nie jest już tak proste jak dla cząsteczki propionitrylu i nawet zaawansowany badacz miałby trudności z przypisaniem odpowiednich sygnałów i sprzężeń. Natomiast na osi pionowej znajduje się widmo węglowe tego samego związku. Także to widmo jest trudne do interpretacji - dużo sygnałów o mało charakterystycznym przesunięciu chemicznym. Okazuje się jednak, że można tak zaprojektować eksperyment, aby otrzymać na widmie korelacje protonów z węglanami - sygnały leżą na "przecięciu" przesunięcia chemicznego protonu i połączonego z danym protonem węgla. Mając do dyspozycji takie widmo łatwo jest już odtworzyć strukturę związku.
Do 1966r. spektrometry NMR rejestrowały widma tzw. metodą fali ciągłej. W stabilnym polu magnetycznym generowanym przez dwa magnesy sztabkowe umieszczano próbkę. Następnie generowano promieniowanie elektromagnetyczne o liniowo zmieniającej się częstotliwości i obserwowano kiedy zajdzie absorpcja. Metoda ta miała jednak wiele wad. Po pierwsze, średni czas rejestracji podstawowego widma protonowego (jest to najprostszy do obserwacji i najczęściej stosowany rezonans) wynosił nawet pół godziny lub dłużej. Po drugie metody tej nie dało się zastosować do innych jąder dających słabszy sygnał, bądź o mniejszym rozpowszechnieniu w przyrodzie (np. węgiel 13C, który jest w praktyce jedynym dającym się obserwować w NMR izotopem węgla, a którego w naturalnych próbkach jest tylko 1,1%).

Pierwszym krokiem do zwiększenia czułości metody było generowanie silniejszego pola magnetycznego - zastosowano elektromagnesy. Zwiększenie pola powoduje, że różnica liczby magnesikow ustawionych równolegle do pola i antyrownolegle zwiększa się (jest to praktycznie zależność liniowa), a wiec liczba jąder dających sygnał również zwiększa się. Metoda ta jednak była mało skuteczna. Mocy magnesów nie dało się zwiększyć aż tak znacznie, aby była możliwa obserwacja jąder mało czułych izotopów. Węgiel 13C tak potrzebny chemikom organikom był ciągle poza zasięgiem NMR-u.
Prawdziwy przełom spowodowało odkrycie profesora Ernsta w 1966r. Wpadł on na pomysł tzw. impulsowej metody rejestracji widm. Polega ona na tym, że próbkę umieszczoną w jednorodnym polu magnetycznym naświetlamy na raz całym zakresem częstotliwości, a potem w ciągu kilku sekund zbieramy widmo. Widmo takie nie jest niestety dla nas zrozumiale w postaci "surowej". Zebrane informacje musimy poddać pewnym matematycznym przekształceniom (zwanym transformacja Fouriera) aby otrzymać widmo takie jak przy rejestracji metodą fali ciągłej. Przy użyciu jednak do wykonania transformacji Fouriera odpowiednio szybkiego komputera, cały cykl otrzymywania widma skraca się z pół godziny (fala ciągła) do kilku sekund. Dodatkową zaletą tej metody jest to, że gdy powtarzamy naświetlanie próbki kolejnymi impulsami i zbieramy informacje wielokrotnie, to szumy uśredniają się, a sygnały dodają. W ten sposób powtarzając wielokrotnie (czasem nawet kilkaset tysięcy razy) cały cykl zbierania informacji możemy spowodować wyniesienie się ponad poziom szumów nawet bardzo słabych sygnałów. Zastosowanie tej metody pozwala nawet na obserwacje jąder takich izotopów, których rozpowszechnienie w przyrodzie wynosi ułamek promila, a próbki badanej posiada się np. 10mg. Dobre widma 1H można robić tą metodą w kilkadziesiąt sekund z próbki 1mg (0,001g - ciężko zauważyć, a co dopiero nabrać na czubek szpilki!). Kolejnym krokiem w NMR było wynalezienie magnesów nadprzewodzących, pozwalających generować pola magnetyczne nawet dziesięciokrotnie silniejsze niż pola pochodzące z elektromagnesów. Sam w sobie taki magnes jest cudem techniki. Solenoid z kilku kilometrów drutu miedzianego z wtopionymi nadprzewodzącymi żyłkami zanurzony w ciekłym helu (temp. wrzenia -269oC) zamknięty w płaszczu próżniowym otoczonym ciekłym azotem i następnym płaszczem próżniowym generuje w całej objętości próbki prawie idealnie jednorodne pole o natężeniu ponad 20T. Magnes taki wygląda jak beczka o wysokości 2m, średnicy około 120cm i wadze dochodzącej do 600kg. Jako ciekawostkę mogę podać, że w Berlinie znajduje się magnes wyprodukowany już kilka lat temu (dający pole o indukcji około 18T) o wysokości dwóch pięter (5m) i wadze kilku ton. Aby umieścić w nim próbkę operator musi wjeżdżać windą na sam jego szczyt, a później zjeżdżać do konsoli operacyjnej.
Rys 4.Widmo korelacyjne mentolu oglądane z innego punktu widzenia. NMR może być także piękny...
Warto też może wspomnieć coś o oprzyrządowaniu nowoczesnego zestawu NMR. Drugim co do ważności elementem konstrukcyjnym tego urządzenia jest tzw. sonda. Jest to element umieszczany w środku magnesu i służący do generowania fali elektromagnetycznej oraz do "zbierania" sygnału. Sygnał ten jest przesyłany później do tzw. komputera akwizycyjnego - czyli po prostu magazynującego kolejne informacje poddawane później "hurtowo" transformacji Fouriera przez kolejny, ostatni już komputer.
Ponieważ zastosowanie metody impulsowej pozwoliło na rozwój wielu szczególnych technik tzw. dwuwymiarowych, wymagających stosowania w czasie jednego cyklu naświetlań próbki kilku lub nawet kilkudziesięciu poszczególnych pulsów o czasie trwania około 10 mikrosekund (określonego z dokładnością do 0,1 mikrosekundy) wiec również sonda wymaga komputerowego sterowania i to przez komputer kilkukrotnie szybszy niż np. PC 486DX. Współczesny zestaw NMR zawiera także przystawkę temperaturową umożliwiającą pomiary w rożnych temperaturach (od około -180oC do około +200oC). Prócz tego twarde dyski o pojemności 2-3GB, dobre kolorowe drukarki do drukowania widm, kilka wzmacniaczy i przedwzmacniaczy sygnału i całą masę najnowocześniejszej elektroniki służącej do obsługi tego wszystkiego.
Jak zapewne każdy się domyśla, operator takiego urządzenia musi posiadać również niecodzienne kwalifikacje. Musi znać się nie tylko na samym NMR, ale również na fizyce, chemii, elektronice i (przede wszystkim) na informatyce. Nowoczesne urządzenie NMR wymaga dość często nawet pisania własnych programów i konstruowania nowych, własnych technik impulsowych oraz metod obróbki danych. Przy obsłudze takiego urządzenia szalenie łatwo jest tez coś popsuć - operator musi się wiec wykazać dużą dozą wyobraźni, ostrożności i po prostu dużym doświadczeniem. W związku z tym prawdziwych, znających się na rzeczy operatorów NMR jest w Polsce najwyżej kilkunastu.

Mikroskop do lamusa?

Okazało się, że NMR można zastosować również w nieco inny sposób w biologii i medycynie. Otóż tak się składa, że każdy organizm żywy zawiera w każdej swej części jakąś (mniejszą lub większą) ilość wody. Może nie wszyscy zdają sobie sprawę, że tyczy się to nawet kości. Jeżeli woda, to mamy do dyspozycji jądra wodoru o jednakowym przesunięciu chemicznym, dające rezonans przy dokładnie tej samej częstości fali elektromagnetycznej gdy pole jest jednorodne.

A co się stanie, jeżeli pole nie będzie idealnie jednorodne, tylko mamy liniowy gradient pola? Otóż wtedy podczas naświetlania próbki falą o pewnej częstości otrzymamy sygnał rezonansowy tylko z jednego przekroju poprzecznego - bo dla innych przekrojów położonych zbyt płytko lub zbyt głęboko, pole będzie zbyt duże lub zbyt małe aby jądra 1H z wody weszły w rezonans. Oceniając intensywność tak otrzymanego sygnału zebranego z każdego kawałka powierzchni przekroju otrzymujemy mapę rozkładu wody w takim przekroju. Zmieniając odrobinę częstość fali elektromagnetycznej możemy obserwować bądź przekroje dalsze, bądź bliższe. W taki sposób można bez jakiejkolwiek ingerencji mechanicznej obserwować dowolny fragment ciała ludzkiego, żyjącego owada, zwierzęcia lub np. kiełkującego ziarna.
Rys. 5.Jądra wodoru z wody położonej w płaszczyźnie przekroju x1 "odczuwają" inną indukcję magnetyczną niż położone w x2, zatem ich częstość rezonansowa będzie inna. Zmniejszając częstość fali elektromagnetycznej możemy wybrać do obserwacji jądro x1 lub x2.

Przewaga NMR nad zdjęciami rentgenowskimi jest dwojaka. Po pierwsze ani pole magnetyczne, ani fale radiowe (bo przeważnie takich używa się w rezonansie) nie są tak szkodliwe jak promienie X, a po drugie NMR daje możliwość wykonania dowolnego przekroju, a nie tylko rzutu na klisze jak w przypadku tradycyjnego prześwietlenia. Stosując NMR możemy także praktycznie bez ograniczeń powiększać sobie dowolny interesujący nas fragment obserwowanego przedmiotu. Zarówno wiec lekarzom jak i biologom NMR daje do ręki potężne narzędzie badawcze.

Podsumowanie

Jak zaznaczyłem na wstępie NMR jest jedną z najdynamiczniej rozwijających się metod współczesnej nauki. I nie jest to tylko slogan. W krajach zachodnich każdy liczący się uniwersytet, szpital, firma farmaceutyczna czy kosmetyczna posiada już własny przyrząd NMR. Każdy taki przyrząd kosztuje od 200 tysięcy do kilku milionów dolarów. Rynek NMR to wiec w praktyce dziesiątki milionów dolarów, które musi wydać każdy, kto zechce się w wyżej wymienionych dziedzinach liczyć. Jest to więc niesamowity wprost kapitał, który popycha tę dziedzinę do przodu, udoskonalając ją i czyniąc coraz bardziej użyteczną, czułą i dokładną. Według mnie, choć sobie z tego nie zdajemy sprawy, współczesny świat nie mógłby się rozwijać, gdyby nie było NMR

Piotr Bernatowicz - Uniwersytet Warszawski (KCh 3/95)

Menu2