Menu1

Prace dyplomowe

Uniwersytet Wrocławski
Wydział Nauk Przyrodniczych
Instytut Biochemii i biologii molekularnej

Piotr Solarz

Metodyka badań nad komponentą oligosacharydową glikoprotein

Praca Licencjacka Wykonana w
Zakładzie Biochemii Molekularnej,
Pod Kierunkiem dra Mariusza Olczaka

Rok Akademicki 1996/1997 - Wrocław


Spis Treści:


I. Wstęp

A. Wprowadzenie

Białka zawierające kowalencyjnie związany łańcuch cukrowy, jako część ich struktury cząsteczkowej, nazywamy glikoproteinami. Takie struktury występują praktycznie we wszystkich żywych organizmach; stwierdzono je u wirusów, grzybów, roślin i zwierząt. Białka często ulegają postranslacyjnej modyfikacji, zmieniając swe właściwości, poprzez: metylację N-końca, acylację, fosforylację, sulfonizację, hydroksylację i glikozylację. Pięć pierwszych z tych zmian nie wymaga specyficznych organelli i jest wspólne dla prio- i eukariota. Glikozylacja jest natomiast procesem typowym wyłącznie dla komórek eukariotycznych. Przyłączenie oligomerów cukrowych może zachodzić przez wiązanie z resztą amidową asparaginy (N-glikozylacja) lub grupą hydroksylową, seryny lub treoniny (O-glikozylacja). W wyjątkowych przypadkach możliwe jest połączenie przez atom siarki z cysteiną (S-glikozylacja). N-glikozylacja rozpoczyna się na szorstkiej siateczce endoplazmatycznej a kończy się w aparacie Golgiego; O-glikoproteiny powstają wyłącznie w aparacie Golgiego. Jak to tej pory nie wykazano jednoznacznie określonej, wzorcowej matrycy dla reszt glikozydowych. Fragment oligosacharydowy odznacza się niespotykaną zmiennością wynikającą: z większej możliwości połączeń pomiędzy cukrami, różnych możliwych konfiguracji monosacharydów oraz faktu istnienia i anomerów. O ile dwupeptyd może istnieć w dwóch formach (pomijając istnienie D-aminokwasów), o tyle dwie identyczne heksozy mogą się ze sobą łączyć na 11 różnych sposobów (Paulus i Klockow 1996). Fakt ten obrazuje tabela 1. Dodatkowo grupy cukrowe mogą być modyfikowane przez acylację, metylację, fosforylację, sulfonizację, jak i aminację (Paulus i Klockow 1996).
Tabela 1*
NDNABiałkaOligocukry**
O=4O=8
142048
216400128800
364800040966.40 x 104
640966.40 x 1071.34 x 1083.27 x 1010
101.04 x 1061.28 x 10131.40 x 10141.34 x 1018
N - liczba monojednostek w polimerze
* Kobata 1994
** Liczba rodzajów monocukrów w oligosacharydzie.
Grupa oligocukrowa odgrywa ważną rolę w procesie przekazywania sygnałów, jak również w reakcjach obronnych. Dodatkowym argumentem przemawiającym za koniecznością badań glikoprotein jest szansa na stworzenie leków nowej generacji, w której to lekarstwa byłyby pochodnymi białek. Badania struktury komponenty cukrowej glikoprotein są jednak trudne technicznie ze względu na dużą różnorodność ich budowy. Glikoproteiny wykazują też często mikroheterogenność związaną z różnicami w budowie poszczególnych oligomerów cukrowych. Poza tym monocukry wchodzące w skład glikanów posiadają bardzo zbliżone właściwości fizykochemiczne, jak: masę, reaktywność, a niektóre z nich (np. kwasy sjalowe) są bardzo nietrwałe. Dlatego badania nad komponentą oligosacharydową glikoprotein rozwinęły się silnie dopiero w ostatnich latach wraz z opracowaniem nowych technik laboratoryjnych.

B. Typy łańcuchów oligocukrowych

Ze względu na sposób połączenia reszty cukrowej z białkiem, łańcuchy glikozydowe możemy podzielić na trzy grupy:

1. N-glikany

Wszystkie N-glikany odznaczają się charakterystycznym rdzeniem Man1-6(Man1-3)Man1-4GlcNAc1-4GlcNAcAsn. Asparagina ta pochodzi z fragmentu białka o ściśle konserwatywnej sekwencji (Asn-X-Ser/Thr), gdzie X może być dowolnym aminokwasem za wyjątkiem proliny i hydroksyproliny. Pomimo wspólnej sekwencji rdzeniowej N-glikany odznaczają się dużą zmiennością oligosacharydów przyłączonych do rdzenia. Dobrze poznane zostały co najmniej cztery typy N-glikanów:
N-glikany o budowie złożonej bądź hybrydowej, mogą zawierać dodatkowe połączenie reszty GlcNAc z pierwszą mannozą rdzenia wiązaniem 1-4. Oprócz tego wszystkie typy N-glikanów mogą zawierać przyłączoną fukozę do rdzeniowej N-acetyloglukozaminy (wiązaniem 1-6 w większości N-glikanów zwierzęcych lub wiązaniem 1-3 w glikoproteinach roślin i niektórych bezkręgowców).N-glikany pochodzące z roślinnych glikoprotein należą do dwóch grup: wysokomannozowych i złożonych. Czynnikiem odróżniającym je od glikoprotein zwierzęcych jest możliwość przyłączenia Xyl1-2 oraz brak kwasów sjalowych (Leurage i Faye 1996). Grzyby posiadają aparat enzymatyczny zdolny do wytwarzania tylko reszt wysokomannozowych.
Synteza N-glikoprotein zaczyna się na szorstkiej siateczce endoplazmatycznej już podczas translacji i rozpoczyna się przeniesieniem dużego oligocukru (Glc3Man9GlcNAc2) umocowanego wiązaniem pirofosforanowym reszty dolicholu. Ostatecznie na Asn zostaje przeniesiony rdzeniowy oligoscacharyd. Wielocukier i transferaza, która katalizuje jego przeniesienie z fosforanu dolicholu na białko, ulokowane są po wewnętrznej stronie cysterny szorstkiego retkikulum endoplazmatycznego. Z tego powodu uważa się, iż niemożliwa jest pełna glikozylacja białek w cytosolu. Już na retikulum endoplazmatycznym odcinane są, z przeniesionego na białko łańcucha Glc3Man9GlcNAc2, kolejno trzy cząsteczki glukozy i jedna cząsteczka mannozy. Glikoproteina, której część cukrowa składa się tylko z Man8GlcNAc2 ulega w aparacie Golgiego fosforylacji lub dodatkowemu skróceniu do Man5GlcNAc2. Po kolejnych modyfikacjach, polegających na odcinaniu dwóch cząsteczek mannozy powstaje rdzeń, który może być wydłużany poprzez dołączanie reszt GlcNAc, by ostatecznie w aparacie trans Golgiego być rozbudowanym poprzez dołączanie cząsteczek, galaktozy i ostatecznie reszt NeuAc.

2. O-glikany

Oprócz możliwości przyłączenia grupy oligocukrowej do asparaginy (N-glikany) w organizmach może wystąpić inny sposób glikozylacji - przyłączenie łańcucha cukrowego do grupy hydroksylowej seryny lub treoniny. W przeciwieństwie do N-glikanów, O-glikany nie posiadają wspólnego rdzenia i odznaczają się większą zmiennością końca redukującego. O-glikany można podzielić na trzy zasadnicze typy: Powyższe struktury mogą być wydłużane poprzez dodawanie Gal przyłączanej wiązaniami 1-3 lub 1-4, albo GlcNAc przyłączanej wiązaniem 1-3, lub 1-6. Koniec nieredukujący może być formowany poprzez dodanie D-Gal, GalNAc, L-Fuc (Schacter 1994).
Dołączanie reszty oligocukrowej typu O-glikozydowego zachodzi tylko w aparacie Golgiego.

3. Glikany z nietypowymi wiązaniami

Rzadko występującym wiązaniem jest wiązanie S-glikozydowe. W tym przypadku glukoza lub galaktoza łączy się przez mostek siarczkowy z cysteiną. Tego typu łańcuchy wykryto w erytrocytach i moczu ssaków (Kobata 1992, Krotkiewski 1982). Innym bardzo rzadko występującym wiązaniem jest połączenie O-glikozydowe z hydroksyproliną (Leurage i Faye 1996) lub z hydroksylizyną w kolagenie (Kłyszejko-Stefanowicz 1995) poprzez GalNAc.
Bardzo ciekawym przypadkiem są proteoglikany (Kobata 1994). W strukturach tych do stosunkowo krótkiego fragmentu peptydowego dołączona jest ogromna liczba (100-200) reszt cukrowych nadających cząsteczce ładunek. Odznaczają się one powtarzającym się dwucukrowym fragmentem. Ostatnio wykazano, iż proteoglikany mogą zawierać oligosacharydy związane zarówno wiązaniami O- jak i N-glikozydowymi, podobnymi do tych jakie znajdują się w glikoproteinach.
Do nietypowych glikoprotein można zaliczyć także błonowe kotwice GPI. Są to glikofosfoproteinolipidy, w których reszta glikofosfolipidowa połączona jest wiązaniem amidowym z C-końcem białka. Wszystkie kotwice GPI odznaczają się konserwatywną strukturą rdzenia: etanoloamina-PO4-6Man1-2Man1-6Man1-4GlcNH21-6mio-inozytol-1-PO4-lipid, w której fragmentem zmiennym w zależności od rodzaju tkanki jest część lipidowa. Synteza kotwic GPI zapoczątkowywana jest w szorstkim retikulum endoplazmatycznym. Proces ten wymaga szeregu przeniesień monocukrów na fosfadydyloinozytol oraz przeniesienia fosforanu etanoloaminy z fosfatydyloetanoloaminy na końcową mannozę.

4. Różnice pomiędzy glikoproteinami roślinnymi a zwierzęcymi

Podstawową cechą odróżniającą glikoproteiny roślinne od zwierzęcych jest częsta obecność Xyl dołączonej wiązaniem 1-2 do pierwszej mannozy rdzenia, jak również sposób wiązania fukozy (wiązaniem 1-3) do pierwszej GlcNAc na końcu redukującym (Ogawa i wsp. 1996). Inną różnicą jest całkowity brak kwasów sjalowych.

5. Glikoproteiny grzybów

Drożdżowe glikoproteiny zarówno typu N- jak i O-glikozydowego mogą być wyłącznie wysokomannozowe z powodu braku w komórce odpowiednich GlcNAc-transeraz. Z tego powodu rekombinowane w drożdżach glikoproteiny mają z reguły inną zawartość komponenty cukrowej.

II. Analiza struktury komponenty cukrowej

A. Wykrywanie obecności cukrów w białkach

1. Inerakcje z lektynami

Lektyny są klasą białek wykazujących bardzo duże powinowactwo do węglowodanów. Posiadają zdolność do hemoaglutynacji i występują powszechnie w organizmach żywych. Do bardzo dobrze poznanych należą takie z nich, jak: konkanawalina A, lektyna z ziaren soi, lektyna z grochu.
Przeważnie reszty cukrowe, z którymi mogą reagować lektyny znajdują się na końcu łańcucha po stronie nieredukującej; istnieją jednak i takie rodzaje lektyn, które wykazują powinowactwo do glikanów znajdujących się w jego wnętrzu. Typowa stała asocjacji lektyn z mono- i wielocukrami waha się w granicach od 103 M-1 a 107 M-1. Wiązanie lektyn z białkiem stanowi , iż dane białko jest glikoproteiną.

2. Metoda fenolowa

Jest metodą kolorymetryczną pozwalającą na analizę jakościową i ilościową cukrów występujących w ilościach większych niż 10 nmoli. W metodzie tej wykorzystuje się fakt, iż stężone kwasy odwadniają cukry proste (oligo- i poliwęglowodany ulegają wpierw hydrolizie) do furfuralu w przypadku pentoz, i oksymetylenofurfuralu jeśli cukier jest heksozą. Oba te związki reagują z fenolami dając barwne produkty. Analizy dokonuje się mierząc absorpcję promieniowania o długości fali =490 nm i porównując ją z krzywą wzorcową otrzymaną dla roztworów glukozy. Metoda ta umożliwia również ilościowe oznaczanie zawartości cukrów w białkach (schemat zamieszczono poniżej).

-3H2O
-D-rybozaFurfural

Istnieją odmiany metody fenolowej jak:

3. Barwienie kwasem nadjodowym i fuksyną - reakcja PAS

Oligocukry poddane działaniu kwasu nadjodowego ulegają utlenieniu. Powstały dwualdehyd reaguje z odczynnikiem Schiffa jakim jest fuksyna (odbarwiona kwasem siarkawym) dając barwną, purpurową reakcję. Dodatnią reakcję PAS dają wszystkie nierozpuszczalne polisacharydy jak: Ponadto pozytywną reakcję dają również takie związki jak:


HIO4


F


Schemat reakcji PAS; F- odczynnik Schiffa (fuksyna)

B. Znakowanie i metody detekcji mono- i oligosacharydów

1. Absorpcja promieniowania UV

Tylko nieliczne węglowodany absorbują promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie długości fal używanym w analityce. Oligosacharydy zawierające GlcNAc, GalNAc i kwasy sjalowe mogą być wykryte przy 200 nm (Taverna i wsp. 1995) lub 185 nm (Kakehi i wsp. 1994). Metody detekcji cukrów przy tak niskich długościach fal napotykają jednak na duże trudności techniczne i w związku z tym są rzadko stosowane. Dlatego przy analizowaniu cukrów promieniami UV posługujemy się ich pochodnymi otrzymanymi przez kondensację z aminami aromatycznymi pokazanymi w tabeli 2.

Tabela 2. (Paulus i Klockow 1996)
ZnacznikStrukturaDługość fali [nm]Granica wykrywalności [M]
2-aminopirydyna (2-AP)2408*10-6
kwas
p-aminobenzowy
2854*10-6
ester etylowy kwasu
p-aminobenzowego
3052*10-6
p-aminobenzonitryl

2853*10-7
kwas 8-aminonaftalen-
1,3,6-trisulfonowy (ANTS)
2235*10-7

Oprócz wyżej wymienionych znaczników do znakowania UV używa się takich substancji jak:

2. Znakowanie fluorescencyjne

Bardzo czułą metodą znakowania jest dołączanie markerów fluorescencyjnych. Jako znaczników używa się zwykle pochodnych chinoliny lub naftalenu przedstawionych w tabeli 3.

Tabela 3. (Paulus i Klockow 1996)
ZnacznikStruktura
Długość fali wzbudzenia i emisji [nm]Granica wykrywalności [M]
kwas 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonowy (ANTS)
(laser He-Cd) 325/520 (laser Ar) 275/5205*10-81*10-9
3-(4-carboksybenzoilo)-2-chinolino carboksy aldehyd (CBQCA)
(laser Ar) 457/5523*10-9
ester sukcynimidylowy 5-karboksytetra-metylorodaminy (TRSE)
(laser He-Ne) 543/5805*10-11

Oprócz wymienionych w tabeli markerów do znakowania fluorescencyjnego używa się innych związków:

3. Znakowanie radioaktywne

Podczas oznaczania glikanów za pomocą sekwencjonowania enzymatycznego zwykle znakuje się reszty oligosacharydowe za pomocą NaB3H4. W tym, przypadku w procesie znakowania grupa aldehydowa z redukującego końca przekształca się do grupy alkoholowej.

Do zalet tej techniki można zaliczyć wysoką czułość (obecnie używane detektory są w stanie wykrywać pmol ilości trytu) jak również specyficzność miejsca znakowania. Wszystkie glikany znakowane są na końcu redukującym. Fakt ten pozwala, bez konieczności ciągłego powtarzania procesu znakowania, na monitorowanie glikanów podczas sekwencjonowania enzymatycznego w połączeniu z chromatografią kolumnową, czy HPLC. Określenia struktury glikanu dokonuje się na podstawie względnych mas oligocukrów wyrażonych w jednostkach glukozowych. Ponieważ sekwencjonowanie enzymatyczne postępuje od końca nieredukującego analizowana próba jest przez cały czas widoczna.

4. Wykrywanie cukrów metodą amperometryczną

Detekcja tą metodą jest stosowana głównie w przypadku HPAEC. Więcej szczegółów na ten temat znajduje się w punkcie odnoszącym się do HPAEC.

5. Detekcja cukrów za pomocą refraktometrii

Jest to technika umożliwiająca wykrywanie reszt cukrowych bez potrzeby tworzenia ich pochodnych. Jej wadą jest mała czułość i wynikająca stąd potrzeba używania znacznych ilości cukru. Z tego powodu tą metodę detekcji stosuje się prawie wyłącznie do kalibracji kolumn chromatograficznych za pomocą zhydrolizowanego dekstranu. W połączeniu z innym detektorem wykrywającym badane glikany (np. detektorem fluorescencyjnym) technika ta pozwala na bardzo dokładne wyrażanie masy innych cukrów w jednostkach glukozowych. Rozdziela się wtedy wspólnie na kolumnie mieszaninę analizowanych cukrów i pochodnych dekstranu. Polimery glukozy ze zhydrolizowanego dekstranu są wykrywane refraktometrycznie i stanowią wzorzec dla próbki oligocukru wykrywanego jednocześnie inną metodą.

C. Metody otrzymywania wolnych łańcuchów cukrowych

1. Otrzymywanie i oczyszczanie glikopeptydów

a) enzymatyczna i chemiczna fragmentacja białek

Przystępując do analizy struktury reszt oligosacharydowych glikoprotein pierwszym krokiem jest oddzielenie od siebie poszczególnych łańcuchów oligosacharydowych i otrzymanie ich w czystym chemicznie stanie. W tym celu można przeprowadzić białka w mniejsze fragmenty, starając się tak dobrać warunki, aby do jednego fragmentu peptydowego dołączony był jeden łańcuch cukrowy. Można tego dokonać w dwojaki sposób: Przy fragmentacji enzymatycznej wykorzystuje się bardzo specyficzne proteinazy (najczęściej trypsynę). Proteoliza powinna być zoptymalizowana w stosunku do każdej glikoproteiny i tak dobrana, by możliwe było dalsze proste oczyszczenie glikopeptydów za pomocą HPLC.
Prócz specyficznych cięć łańcucha białkowego za pomocą proteinaz stosuje się także, odkryte przez Bernarda Witkopa i Erharda Grossa, chemiczne cięcie przy użyciu bromocyjanu (CNBr). Bromocyjan przecina łańcuch peptydowy tylko w jednym miejscu - po stronie karboksylowej metioniny.
Innym specyficznym, chemicznym czynnikiem tnącym wiązanie peptydowe pomiędzy asparaginą, a glicyną jest hydroksylamina (Stryer 1995).

b) rozdział peptydów za pomocą HPLC i identyfikacja glikopeptydów

Spośród wielu odmian metod HPLC (między innymi normal phase HPLC) używanych w analizie oligosacharydów bardzo dużym powodzeniem cieszy się metoda odwróconych faz (RP-HPLC) bazująca na różnicach w hydrofobowości analizowanych peptydów. Glikopeptydy wykrywa się wówczas technikami opisanymi wcześniej (reakcje z lektynami, metoda fenolowa itp.).

2. Enzymatyczne metody odcinania oligomerów cukrowych

Dawniej w analizie O-glikanów i N-glikanów aby oddzielić resztę cukrową od szkieletu białkowego posługiwano się zazwyczaj metodami chemicznymi, takimi jak: alkaliczna degradacja (-eliminacja), czy hydrazynoliza (która obecnie cieszy się znowu uznaniem). W ostatnich dwóch dekadach "do głosu doszły" metody enzymatyczne, wykorzystujące glikozydazy. W analizie N-glikanów wykorzystujemy endoglikozydazy mające specyficzne działanie (rysunek poniżej).

X1


 PN Gaza 
X2Man1



 Z
|
YMan1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
X3


Man1  
X4 endoglikozydaza
(O"Neill. 1996) Ogólny schemat reakcji enzymatycznego odcinania N-oligoglikanu od peptydu. X - możliwe dalsze wydłużanie łańcucha przez wiele różnych monocukrów, Y - możliwe wiązania GlcNAc, Z - możliwa pozycja fukozy.

a) Enzymy uwalniające N-związane reszty sacharydowe:

  1. Pierwszym enzymem stosowanym w analizie glikoprotein była endoglikozydaza z Diplococus (Straptococcus) pneumoniae nazywana endo D (Maramatsu 1971). Specyficzność tego enzymu jest ograniczona i nie wszedł on do powszechnego użycia w analizie glikoprotein. Endo D jest w stanie uwalniać od szkieletu peptydowego wysokomannozowe N-glikany, tylko z tych oligosacharydów, w których reszta mannozy związana wiązaniem 1-3 posiada wolną grupę hydroksylową przy węglu C-2 (Maramatsu 1988). Miejsce cięcia tego enzymu, jak i innych omawianych tutaj endoglikozydaz, znajduje się za pierwszą GlcNAc rdzenia.
  2. Endoglikozydaza ze Streptomyces plicatus (endo H) została opisana zaraz po endo D, a obecnie rekombinowana jest w E. coli. Odcina reszty wysokomannozowe i hybrydowe N-glikany. Jest nieaktywna wobec złożonych wielocukrów (Trimble i Tarentino 1991).
  3. Endoglikozydazy z Clostridium peringens: endo CI i endo CII zostały opisane w 1975 roku. W swej specyficzności substratowej są bardzo podobne do endo D i endo H, jednak posiadają większe ograniczenia substratowe, praktycznie nie są używane w analizie glikoprotein (O"Neill. 1996).
  4. Endoglikozydazy: endo F1, F2, F3 otrzymano z Flavobacterium meningosepticum obecnie rekombinuje się je w E. coli. Są to bardzo popularne i szeroko stosowane enzymy. Specyficzność endo F1 jest podobna do specyficzności endo H mając zdolność do odcinania zarówno wysokomannozowych jak i hybrydowych łańcuchów. Endo F2 jest aktywna wobec wysokomannozowych N-glikanów, wykazując również duże powinowactwo wobec dwuantenowych. Nie posiada za to zdolności do odcinania łańcuchów: hybrydowych, trzyantenowych i czteroantenowych (O"Neill. 1996). Endo F3, w przeciwieństwie do dwóch wcześniejszych, nie wykazuje powinowactwa do N-glikanów wysokomannozowych (O"Neill. 1996), jest w stanie odcinać oligosacharydy trzyantenowe. Wszystkie trzy endoglikozydazy są przeważnie sprzedawane łącznie jako endoglikozydaza F; preparat ten składa się głównie z endo F1 oraz małych ilości endo F2 i F3. W przypadku prowadzenia reakcji w środowisku glicerolu zaobserwowano przyłączanie glicerolu do redukującego węgla GlcNAc (Trimble i wsp. 1986). Z czasem glicerol zostawał zastąpiony przez wodę (Maley i wsp. 1989). To samo zjawisko odkryto w stosunku do endo H z tym, że proces ten był wolniejszy (Maley i wsp. 1989).
  5. Do innych mało popularnych, niebakteryjnych endoglikozydaz można zaliczyć: endo S ze ślimaka Distyostellium discoideum (podobną do endo CII), grzybowe endo M z Mucor hiemalis oraz endo B ze Sporotrichum dimorphosporum (podobne w działaniu do endo F2, a różniące się od niej zdolnością cięcia łańcuchów hybrydowych). Istnieją doniesienia o endoglikozydazach z roślin wyższych podobnych do endo CII oraz ssaków (np. endoglikozydaza z wątroby szczura podobna do endo F2 (Tachibana, Yamashita i Kobata 1982, Lisman i wsp. 1985)).
    Drugą rodziną enzymów uwalniających grupy oligosacharydowe są
    N-glikozydazy (nazywane inaczej jako: PNGazy, N-glikohydrolazy lub N-glikanazy) odcinające łańcuch cukrowy przy samej asparaginie. W trakcie tego procesu amid kwasu asparaginowego przekształca się w kwas asparaginowy, a oligosacharyd jest uwalniany jako glikozoamina. W stosunku do opisanych wcześniej endoglikozydaz, pozostawiających przy asparaginie cząsteczkę GlcNAc, posiadają wady i zalety. Do wad można zaliczyć fakt utraty przez GlcNAc grupy aminowej na C-1 (Takhaschi 1992) oraz częstą konieczność denaturacji hydrolizowanych glikoprotein, do zalet bardzo szerokie spektrum działania umożliwiające uwolnienie reszty glikozowej bez wcześniejszej znajomości jej struktury.
    N-glikozydazy pochodzące z różnych źródeł wydają się być bardzo podobnymi w swej charakterystyce substratowej i umożliwiają trawienie wszystkich typów N-glikanów jak: wysokomannozowe, złożone i hybrydowe. Istnieją pomiędzy nimi jednak subtelne różnice ważne w praktycznym zastosowaniu do analizy N-glikanów.
    1. N-glikozydaza A z migdałów została po raz pierwszy oczyszczona do homogenności przez Taga (Taga 1984) i jest ona w stanie hydrolizować każde wiązanie N-glikozydowe (ciekawostką jest możliwość hydrolizy nawet pojedynczej reszty GlcNAc, która pozostała po działaniu endoglikozydazą, od asparaginy (Plumer i wsp. 1981). Wykazuje ona dużo mniejszą aktywność w stosunku do dużych glikozylowanych białek niż mniejszych glikoprotein, a denaturacja glikoproteiny ułatwia hydrolizę. Przypuszcza się, że większa aktywność w stosunku do mniejszych białek spowodowana jest stosunkowo dużą masą enzymu wynoszącą prawie 80 000 Da (dla porównania masa N-glikozydazy F wynosi tylko 35 000 Da). Ważną cechą tego enzymu jest niezdolność do usuwania N-glikanów z asparaginy położonej blisko C-końca. Jest to cecha charakterystyczna również dla N-glikozydazy F (Plumer i wsp. 1981). Optymalne pH dla działania tego enzymu zawiera się pomiędzy 4 a 6.
    2. N-glikozydaza F otrzymywana z Flavobacterium meningosepticum jest najczęściej używanym enzymem. W przeciwieństwie do PNGazy A, nie jest w stanie odcinać pojedynczej grupy GlcNAc przyłączonej wiązaniem N-glikozydowym do asparaginy. Inną cechą odróżniającą N-glikozydazę F od A jest brak powinowactwa enzymatycznego w stosunku do N-glikanów zawierających fukozę przyłączoną do pierwszej rdzeniowej GlcNAc wiązaniem 1-3. Optymalne pH dla działania tego enzymu wynosi około 8.6.
    3. N-glikozdaza z fasoli wszystkich rodzajów oligosacharydów (O"Neill. 1996). Optymalne pH dla działania tego enzymu wynosi 6.5.

    b) Enzymy uwalniające O-glikany

    Często występująca O-glikozydowa struktura jest Gal1-3GalNAc (Schacter 1986), może być zhydrolizowana przez enzymy prokariotyczne (endo-GalNAc-aza D z Diplococus (Straptococcus) pneumoniae (Endo i Kobata 1976) jak i eukariotyczne (endo-GalNAc-aza A z Alcaligens (Fan, Kadowaki i wsp. 1988). Powyższe enzymy są w stanie hydrolizować tylko dwucukrową strukturę Gal1-3GalNAc bez żadnych podstawień (O"Neill 1996). O-glikany są jednak często bardziej zróżnicowane, a ich fragment Gal1-3GalNAc rozbudowany. Optymalne pH dla tego enzymu wynosi 5.5. Ostatnio pojawiły się doniesienia o nowym, słabo zdefiniowanym enzymie ze Streptomyces opisanym jako endo-GalNAc-aza S (Iwase i wsp. 1988), który jest w stanie hydrolizować większe struktury, niż opisane powyżej, na przykład Gal1-3(Gal-1-4GlcNAc1-6)-GalNAc.

    3. Chemiczne metody odcinania łańcuchów cukrowych

    Metodą stosowaną przez prawie trzy dziesięciolecia jest hydrazynoliza. Zazwyczaj stosowano ją do uzyskiwania puli N- i O-glikanów, chociaż ostatnio donosi się, iż bezwodna hydrazyna jest w pewnych warunkach wysoce specyficzna wyłącznie wobec O-glikanów (O"Neill 1996, Patel i wsp. 1993).
    W metodzie hydrazynolizy odwodnione, świeżo przygotowane próby glikoprotein, lub glikopeptydów inkubuje się z minimalną objętością ultraczystej bezwodnej hydrazyny w atmosferze suchego, odwodnionego argonu. W procesie tym ponad 85% N- i O-glikanów zostaje zwolnionych przy inkubacji przez 4 h w 95oC.
    Natomiast O-glikany są uwalniane specyficznie w temperaturze 60oC i przy inkubacji trwającej 6 h. Modyfikacja metody polega na zauważeniu faktu, iż w niższych temperaturach bezwodna hydrazyna uwalnia powyżej 90% glikanów związanych wiązaniem O-glikozydowym i mniej niż 10% N-glikanów.
    Ograniczeniem hydrazynolizy jest utrata grup acetylowych i glikozowych z cukrów podstawionych N-acetylo i N-glikozydowo. W przypadku hydrolizy O-glikanów często otrzymuje się niepożądane pochodne (O"Neill 1996).
    Wadą tej metody jest konieczność używania bardzo czystego bezwodnego związku, którego otrzymanie jest niebezpieczne ze względu na toksyczności i wybuchowość.
    Inną techniką chemiczną stosowaną do uwalniania reszt cukrowych z glikoprotein i glikopeptydów jest odcinanie łańcucha za pomocą wodorolitku aluminium (Likhosherstow i wsp. 1990).

    D. Sekwencjonowanie enzymatyczne

    Do enzymatycznej analizy struktury łańcuchów oligosacharydowych stosuje się sekwencjonowanie enzymatyczne za pomocą egzo- endoglikozydaz wykazujących bardzo wysoką specyficzność względem:
    • rodzaju mono- i oligosacharydu
    • anomerii (/)
    • rodzaju wiązania
    • stereoizomerii (D/L)
    • rodzaju pierścienia (piranozowy/furanozowy)
    Ilość próby potrzebnej do oznaczania za pomocą egzo- endoglikozydaz waha się (w zależności od czułości i objętości próby wymaganej przez metodę) od 10 do 100 pmoli. Ogólnie wszystkie metody detekcji stosowane w sekwencjonowaniu enzymatycznym dzieli się na dwie grupy: jedna wykorzystuje wielkość cząsteczek np. wszelkiego rodzaju chromatografie, elektroforezy i spektroskopie masowe; druga ich właściwości przestrzenne, rodzaje występujących w nich wiązań np. rozdział z użyciem lektyn i sporadycznie NMR (choć ta ostatnia technika częściej używana jest do analizowania "natywnych" glikanów jeszcze przed trawieniem egzoglikozydazami).
    Jako standardu w technikach bazujących na zmianie wielkości cząsteczek używa się zhydrolizowanego standardu dekstranu przygotowanego poprzez ogrzewanie jednego grama dekstranu (200 000 Da) w 10 ml 0.1 M HCl przez 4 h w 100oC. Przystępując do analizy enzymatycznej należy ustalić z jakim rodzajem glikanu mamy do czynienia. Fakt ten rzutuje potem na rodzaj użytych enzymów. Wybór enzymu jest zwykle uzależniony od składu monosacharydowego próby otrzymanego np. w drodze analizy metylacyjnej połączonej GC-MS lub z użyciem lektyn oraz od drogi glikozylacji (jeśli jest ona znana). Szczególnie ważne przy sekwencjonowaniu enzymatycznym jest ścisłe przestrzeganie warunków inkubacji próby z enzymem. Na przykład w odpowiednich warunkach używając -mannozydazy z Conavalia ensiformis hydrolizie ulegają wiązania Man1<--2,3,6. W innym przypadku niektóre wiązania mogą nie ulegać hydrolizie (Dwek i wsp. 1993). Czynnikami, których należy ściśle przestrzegać są: czystość enzymu, stężenie substratu, pH, siła jonowa, rodzaj użytego buforu, temperatura, czas reakcji. Niezachowanie któregoś z tych warunków może uczynić eksperyment niepowtarzalnym i spowodować błędy w określaniu struktury analizowanej próby.
    Przykład najczęściej stosowanych endo- i egzoglikozydaz przy analizie glikanów przedstawia tabela 4. Prócz tych wymienionych w tabeli 4 enzymów stosuje się jeszcze endoglikozydazy wymienione w rozdziale opisującym enzymatyczne uwalnianie reszt cukrowych z glikoprotein i glikopeptydów.
    Etap hydrolizy enzymatycznej łączy się z innymi technikami, jak immobilizacja na złożach zawierających lektyny, różne rodzaje chromatografii, elektroforezy, etc.
    W ostatnich latach firma Oxford GlycoSystem (katalog Oxford GlycoSystem na rok 1994) prezentuje nowa technikę RAAM będącą pochodną sekwencjonowania enzymatycznego. W technice tej miast używać po kolei szeregu różnych egzoglikozydaz używa się ich mieszaniny. Próbę dzieli się na kilka części i inkubuje każdą w oddzielnych probówkach z odpowiednio dobranymi mieszaninami glikozydaz. Następnie całość zlewa się do jednego naczynia i poddaje analizie. Modyfikacja ta pozwala na określenie struktury glikanów za pomocą "jednego kroku". Wyniki rozdziału chromatograficznego mieszaniny reszt cukrowych otrzymanych w tym procesie poddaje się analizie za pomocą oprogramowania komputerowego.

    Schemat sekwencjonowania metodą RAAM (na podstawie katalogu Oxford GlycoSystems 1994) dla N-glikanu o przykładowej strukturze:

    • Oznaczenia cukrów: mannoza; n GlcNAc; u fukoza; s galaktoza.
    • Oznaczenia macierzy RAAM - obecność enzymu o danej specyfice; m - nieobecność danego enzymu
    Używane enzymy:
    1. -Nacetyloheksozoamidaza (S. pneumoniae)
    2. -3/4-fukozydaza (ziarno migdałów)
    3. -fukozydaza (jądra wołu)
    4. -Nacetyloheksozoamidaza (kanawalia mieczokształtna)
    GU - masy produktów reakcji wyrażone są w jednostkach glukozowych. Powstałe produkty zlewa się, powstałą mieszaninę rozdziela się w HPLC.

    Tabela 4. Przykłady glikozydaz używanych w analizie glikanów (Dwek i wsp. 1993).
    EnzymOznaczenie ECŹródłoSpecyficzność
    -D-sjalidaza3.2.1.18Arthobacter ureafaciens
    Clostridium perfringens
    Vibrio cholerae

    wirus Choroby Newcastle

    NeuNAc/NeuGc2-->6 > 3, 8
    NeuNAc/NeuGc2-->3, 6, 8
    NeuNAc/NeuGc2-->3, 6, 8
    NeuNAc/NeuGc2-->3, 8

    -D-galaktozydaza3.2.1.23jądra wołu
    Escherichia coli(Conavalia ensiformis)
    Streptococcus pneumoniae

    Gal1-->3 > 4 > 6
    Gal1-->4Glc
    Gal1-->6 > 4 >> 6
    Gal1-->4

    -D-galaktozydaza3.2.1.22ziarno kawyGal1-->3, 4, 6
    -N-acetylo-
    -D-heksoaminidaza
    3.2.1.30Canavalia enciformis
    Streptococcus pneumoniae

    Glc(Gal)NAc1-->2, 3, 4, 6

    -N-acetylo-D-heksoaminidaza3.2.1.49

    wątroba kurczaka
    wątroba z prosiaka

    GalNAc1-->

    -D-mannozydaza3.2.1.24Canavalia enciformis Asparagillus phoenicins IMan1-->2, 3, 6
    Man1-->2
    -D-mannozydaza3.2.1.25Helix pomatia
    Achatina fulica
    Man1-->4
    -L-fukozydaza3.2.1.51Charonia lampas
    nadjądrza wołu
    migdały I migdały II

    Fuc1-->2, 3, 4, 6 Fuc1-->6 > 2, 3, 4
    Fuc1-->2
    Fuc1-->3, 4

    -D-ksylozydaza Charonia lampas

    Xyl1-->2

    1. Analiza za pomocą kolumn sitowych

    W filtracji oligoglikanów to najczęściej stosuje się miękkie wypełnienia takie jak Bio-Gel P-4 (Bio-Rad) lub Sephadex G-25 (Pharmacja). Bio-Gel P-4 jest stosowany częściej, ponieważ nie zawiera grup cukrowych, które mogłyby interferować z badanym materiałem (Fukuda i Kobata 1993). W połączeniu z hydrolizą enzymatyczną za pomocą egzoglikozydaz i chromatografią na złożach zawierających lektyny metoda ta pozwala na całkowite określenie struktury analizowanych oligosacharydów. Dzieje się tak dlatego, iż każda reszta monosacharydowa w zależności od umiejscowienia w glikanie wpływa w różny sposób na zachowanie się łańcucha podczas chromatografii. Jako standardu służącego do kalibracji kolumny używa się zhydrolizowanego standardu dekstranu przygotowanego poprzez ogrzewanie dekstranu (200 000 Da) 0.1 M HCl przez 4 h w 100oC. Hydrolizat zawiera liniowe polimery glukozy o różnej długości.
    Wadą tej metody jest potrzeba stosowania dużych ilości analizowanego materiału oraz czasochłonność. Pojedynczy rozdział trwa około 6 - 7 dni, a do pełnej charakterystyki oligomeru należy wykonać chromatografie po inkubacji z conajmniej kilkoma glikozydazami.

    2. Analiza W HPLC

    HPLC używane jest przy analizie strukturalnej oligosacharydów do rozdzielania poszczególnych fragmentów węglowodanowych, powstałych np. przez trawienie glikozydazami, od siebie. Dzięki możliwości użycia w stosunku do małych ilości próby, możliwości współdziałania z różnymi rodzajami detekcji i prostocie obsługi technika ta jest najczęściej używaną w analityce. W tej technice kolumny kalibruje się również zhydrolizowanym dekstranem.

    a) HPAEC (DIONEX)

    Chromatografia jonowymienna połączona z pulsacyjną detekcją amperometryczną (PAD) stała się jedną z odmian HPLC najczęściej używanych przy analizie neutralnych mono- i oligosacharydów (Townsend i Hardy 1991). Rozdziału dokonuje się bazując na wiązaniu oksyanionów, powstających w bardzo wysokim pH (pH 12-14), do złoża jonowymiennego. Selektywność uzależniona jest od tego jaka grupa hydroksylowa pochodząca z węglowodanu ulegnie przemianie w oksyanion oraz od zdolności tego oksyanionu do wiązania z grupami aminowymi fazy stałej. Najwięcej oksyanionów powstaje z grup hydroksylowych pochodzących od C-2 w przypadku heksoz i C-3 w przypadku aminocukrów. Jako że O-glikany są niestabilne w wysokich wartościach pH technikę tą stosuje się głównie do N-glikanów. Użycie detektora PAD nie wymaga tworzenia pochodnych analizowanych cukrów. Dzięki tej zalecie technika HPAEC-PAD używana jest do śledzenia reakcji enzymatycznych (Lee 1996). Z powodu właściwości korozyjnych rozpuszczalnika sprzęt do tego rodzaju chromatografii winien być odporny na wysokie wartości pH.
    Podczas rozdziału w środowisku silnie zasadowym może zachodzić epimeryzacja i degradacja niezredukowanych wcześniej cukrów. Z tego powodu wielu badaczy poddaje wpierw analizowaną próbę redukcji (Lee 1996). W celu zredukowania stężenia jonów OH- stosuje się jako eluent dodatek jonów octanowych lub azotanowych.

    b) Normal Phase HPLC

    Chromatografia na tego rodzaju kolumnach używana jest do separacji neutralnych i kwaśnych alditoli O- i N-glikanów (Bregh, Koppen i van den Ejinden 1981). Zarówno dla neutralnych jaki i kwaśnych oligosacharydów czas retencji jest zależny nie tylko od składu oligomeru lecz także od jego struktury przestrzennej. Spośród wielu rodzajów kolumn używa się głównie kolumn krzemianowych z przyłączonymi grupami aminowymi, tzw. kolumn amidowych. W tym rodzaju chromatografii, próbę nanosi się w rozpuszczalniku niepolarnym np. w acetonitrylu lub metanolu, a następnie wypłukuje się ją z kolumny rosnącym gradientem rozpuszczalnika polarnego (np.: słabych roztworów soli w wodzie).

    c) HPLC na odwróconych fazach (RP-HPLC)

    Metoda służy do analizowania N-glikanów na alkalizowanych (np. C18) kolumnach krzemianowych. Jak do tej pory nie ma doniesień o stosowaniu tej techniki do analizowania O-glikanów (Glycobiology 1993 s. 316, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York). Jako eluenta niepolarnego używa się acetonitrylu lub metanolu; korzystniej jest używać acetonitrylu, gdyż odczynnik ten wymaga mniejszych stężeń w stosunku do metanolu. W technice tej próbę nanosi się rozpuszczoną w roztworze wodnym, wymywa się rosnącym gradientem CH3CN.

    3. Elektroforeza

    Technika ta jest stosowana do określania struktury oligosacharydów na zasadzie podobnej jak w przypadku zastosowania kolumn sitowych (wyznaczanie masy oligomerów po enzymatycznej hydrolizie egzoglikozydazami).

    a) w żelu poliakrylamidowym (PAGE)

    Pociętą różnymi egzoglikozydazami próbę oligosacharydu znakuje się fluorescencyjnie przed naniesieniem na żel poliakrylamidowy z SDS. Na żel ten również nanosi się standard otrzymany w wyniku częściowej hydrolizy dekstranu. Po przeprowadzeniu rozdziału żel umieszcza się w skanerze, a odpowiedni program komputerowy dokonuje analizy strukturalnej badanej próby. Żel po rozdziale glikanów można też poddawać blottingowi, a do barwienia cukrów używać biotyny. Metoda ta nie wymaga otrzymania fluoroscencyjnych pochodnych, a zastosowanie specyficznych lektyn pozwala na określenie struktury reszty cukrowej pochodzącej z glikoproteiny (wg. katalogu 1994 firmy Bio-Rad s. 167-169).

    b) kapilarna (CE)

    Metoda odznaczająca się bardzo wysoką czułością w porównaniu z innymi i umożliwiającą analizę śladowych ilości preparatu. Ograniczenia związane są z detekcją określają ilości materiału potrzebnego do próby. Dla detekcji za pomocą promieni UV typowe stężenie preparatu powinno być większe niż 10-6 M analogicznie dla detekcji elektrochemicznej i fluoroscencyjnej 10-8 M, by dla fluorescencji indukowanej laserem (LIF) osiągnąć wartość 10-11 M. Ze względu na fakt, iż dla typowej elektroforezy kapilarnej objętość nanoszonych preparatów jest mniejsza niż 10 m l, w bardzo małych kapilarach istnieje możliwość analizowania prób nawet o stężeniu 40*10-24M metodą fluorescencji indukowanej laserem (Paulus i Klockow 1996).

    4. Powinowactwo do specyficznych lektyn

    Jednym z największych problemów w analizie grup oligocukrowych jest oddzielenie glikanów od siebie. Można tego dokonać za pomocą wcześniej wymienionych technik jak: HPLC, czy sit molekularnych, jednak rozdział w tych technikach opiera się bardziej na wielkości i ładunku grup oligosacharydowych niż na ich strukturze przestrzennej. Z tego powodu jedną z najczęściej używanych metod do separacji, oczyszczania i analizy glikanów jest chromatografia na złożach zawierających immobilizowane lektyny. Używając lektyn stosunkowo łatwo jest wyizolować izomery strukturalne oligoglikanów.
    Klasyfikacja lektyn opiera się na ich wysokim i specyficznym powinowactwie do cukrów i tak wyróżnia się następujące ich rodzaje:
    • mannozowe, galaktozowe i L-fukozowe
    • N-acetyloglukozoaminowe
    • N-acetylogalaktozoaminowe
    • kwasu N-acetyloneuraminowego

    a) Przygotowanie złoża

    Oczyszczone lektyny powinny być związane z nierozpuszczalnym nośnikiem, zwykle używa się w tym celu żelu Sepharose (Pharmacja), będącego pochodną nierozpuszczalnego dekstranu. Proces ten przeprowadza się w obecności odpowiednich cukrów, mających na celu ochronę aktywnej domeny lektyn. Istnieje wiele metod immobilizacji lektyn. Białka te wiąże się z aktywowanymi grupami dekstranu przez najbardziej reaktywne grupy aminokwasów, takie jak aminowe, karboksylowe i sulfhydrylowe. Można też wiązać lektyny przez ich część cukrową.

    b) Postępowanie z immobilizowanymi lektynami

    Zdolność do wiązania lektyn z grupami sacharydowymi zależy w dużej mierze od warunków jakich w dany proces ma miejsce. Wpływają na nią takie zmienne jak na przykład: ilości lektyn na objętość żelu, rozmiar kolumny, temperatura, prędkość przepływu przez kolumnę. Dlatego też kolumny z immobilizowanymi lektynami muszą być stadardyzowane przed użyciem za pomocą oligosacharydów i glikoprotein o określonej już strukturze, aby upewnić się co do ich reaktywności, specyficzności i powtarzalności.
    Przy badaniach strukturalnych oligosacharydów stosuje się szereg chromatografii na różnych immobilizowanych, specyficznych lektynach.
    Tabele 5 i 6 przedstawiają specyficzność lektyn wobec niektórych reszt glikozydowych.

    Tabela 5. Struktura oligosacharydów 1--12 i ich zachowanie w lektynowej seryjnej chromatografii powinowactwa; rozmiar kolumny:
    0.7cm * 2.6cm. (Glycobiology 1993 s. 316, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York)

    NStruktura
    Con ADSAE4-PHA (20oC)E4-PHA (4 oC)L4-PHA
    1
    Man1-6
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    +a----
    2
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6
    Man1-3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    +--r-
    3
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    +--r-
    4
    Man1-6
    Gal1-4GlcNAc13Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    ++b---
    5
    Gal1-4GlcNAc13Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6
    Man1-3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    ++-r-
    6
    GlcNAc1
    |
     
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3
    4
    Man1
    -4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    --rr-
    7
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1


    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1
    -r-r-
    8
     GlcNAc1
    |
     
    Gal1-4GlcNAc1-2Man1


    6
    3
    4
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    -rrr-
    9
    Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-2Man1


    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1
    -+-r-
    10
     GlcNAc1
    |
     
    Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-2Man1


    6
    3
    4
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    -+rr-
    11
    Gal1-4GlcNAc1-6
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Man1


    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Man1
    -+--r
    12
    Gal1-4GlcNAc1-6
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Man1

    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    Gal1-4GlcNAc1-2
    Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1
    -+--r
    a - wymywane 5mM -metyloglukopiranozą w TB-NaN3b- wymywane 1% oligomerem N-acetyloglukozoaminy w TB-NaN3

    Tabela 6. (Glycobiology 1993 s. 249, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York)
    Oligosacharyd
    LektynaGęstość wiązaniaHapten
     *Fuc1
    |
     
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc
    1-2Man1-6
    1-2Man1-3
    Man1
    -4GlcNAc1- 6
    4GlcNAc
    -Asn
    Conavalia ensiformis (Con A) 15 mg/ml-metyloglukoza (10 mM)
    Man1-6
    Man1-3
    Man1


    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
    Conavalia ensiformis (Con A) 15 mg/ml-metylomannoza (100mM)
    *Man1-2*Man
    *Man1-2Man
    1-6
    1-3
    Man1

    6
    3
    Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
    Conavalia ensiformis (Con A) 15 mg/ml-metylomannoza (100mM)



    *NeuAc2-6(3)Gal1
    *NeuAc2-6(3)Gal1
     Fuc1
    |
     
    -4GlcNAc1-2Man1-6
    -4GlcNAc1-2Man1-3
    Man1-4GlcNAc1- 6
    4GlcNAc
    -



    Asn
    Lens culinarisPisum sativum (lektyna z grochu) 15 mg/ml-metylomannoza (100mM)
    Lens culinarisPisum sativum (lektyna z grochu) 15 mg/ml-metylomannoza (100mM)
     *Fuc1 
    *NeuAc2-6(3)
    *NeuAc2-6(3)
    Gal1-4GlcNac1-6
    Gal1-4GlcNac1-2
    Man
    1
    6
    3

    Man1-4GlcNAc1-
    |
    6
    4GlcNAc

    -Asn
    *NeuAc2-6(3) Gal1-4GlcNac1-2Man 1
    Phaseolus volgaris(L4PHA) 10 mg/mlGalNAc (0.4 M)
     *Fuc1 
    *NeuAc2-6
    *NeuAc2-6
    (3)Gal1-4GlcNac1-6
    (3)Gal1-4GlcNac1-2
    Man1

    6
    3

    Man1-4GlcNAc1-
    |
    6
    4GlcNAc

    -Asn
    *NeuAc2-6 (3)Gal1-4GlcNac1-2Man1
    Phaseolus volgaris(L4PHA) 10 mg/mlGalNAc (0.4 M)
     *Fuc1
    |
     
    *NeuAc2-6(3)Gal
    1-4GlcNAc1-2Man16
    3
    Ma
    GalNAc1-4
    1-4GlcNAc1-2Man1
     6 
     n1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal 
    Phaseolus volgaris(L4PHA) 10 mg/mlGalNAc (0.4 M)
     *Fuc1
    |
     
    *NeuAc2-6(3)
    (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc
    1-2Man16
    3
    Man1-4GlcNAc1-6
    4GlcNAc
    -Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
    Phaseolus volgaris(L4PHA) 8 mg/mlmieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
     *Fuc1  
    *NeuAc2-6(3)
    (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc
    1-6Man16
    3
    Man1-4GlcNAc1-|
    6
    4GlcNAc
    -Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2
    *NeuAc2-6(3)*Gal1-4GlcNAc1-4
    Man1
    Lycopersicon esculentum (lektyna z pomidorów) 8 mg/mlmieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
     *Fuc1
    |
     
    *NeuAc2-6(3)
    (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc
    1-2Man16
    3
    Man1-4GlcNAc1-6
    4GlcNAc
    -Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
    Lycopersicon esculentum (lektyna z pomidorów) 15 mg/mlmieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
     *Fuc1  
    *NeuAc2-6(3)
    (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc
    1-6Man16
    3
    Man1-4GlcNAc1-|
    6
    4GlcNAc
    -Asn
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2
    *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2
    *NeuAc2-6(3)*Gal1-4*GlcNAc1-4
    Man1

    n = 0,1 i >2
    Datura stramonium(DSA) 15 mg/mlmieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
    NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-
    Maackia amurensis (MAL lub MAM) 10 mg/mlLaktoza (100 mM)
    NeuAc2-3Gal1
    -4GlcNAc1-
    Sambucus nigra aglutynina (SNA) 10 mg/mlLaktoza (100 mM)
    Gal1-3
    Gal1-4GlcNAc1-
    Griffonia simplicifolia (I-B4; GS-I-B4) 15 mg/mlRafinoza (100 mM)
    GalNAc1-3
    Gal1-4GlcNAc1-
    Helix pomatia aglutynina (HPA) 5 mg/mlGalNAc (10 mM)
    Gal1-4GlcNAc
    1-
    Ricinus communis aglutynina (RCA-I) 20 mg/mlLaktoza (100 mM)
    GalNAc1-4
    GlcNAc1-
    Wisteria floribunda aglutynina (WFA) 10 mg/mlGalNAc (50 mM)
    Fuc
    |
    2
    Gal
    1-4GlcNAc1-
    Ulex europaesus I (UEA-I) 10 mg/mlFuc (100 mM)
    symbol * oznacza +/-

    E. NMR

    Jest to technika pozwalająca na określenie struktury oligosacharydu bez niszczenia próby. Jeżeli widmo nieznanego oligosacharydu jest identyczne z widmem poznanego już związku, to oba związki są takie same. Metoda ta wymaga jednak bardzo drogiego sprzętu o wysokiej jakości. Uważa się, że do analizy cukrów powinno się używać aparatów co najmniej 600 MHz. Technika ta wymaga również wysokiej wiedzy w analizie wyników, gdyż widma różnych substancji są do siebie bardzo podobne. W praktyce nie zawsze istnieje konieczność analizowania całego spektrum. Często wystarczy analiza sygnałów pochodzących z tak zwanych "structural reporter groups" (Vliegenthart i wsp. 1981). Najważniejszymi obszarami widma są: anomeryczny (C1H) od 4.2 do 5.5 ppm i region od 1.0 ppm to 3.0 ppm zawierające rezonansy metylowe.

    1. Rozpuszczalniki

    Aby próbę móc poddać analizie należy ją przenieść do rozpuszczalnika, który nie może zawierać nawet najmniejszych ilości 1H. Próba musi być wcześniej odsolona. Przy analizie węglowodanów najczęściej używanym rozpuszczalnikiem jest D2O. Ciężka woda pochodząca od różnych dostawców może się dość znacznie różnić czystością i pH (pD). Dlatego też przed rozpuszczeniem w niej wartościowej próby należy sprawdzić jej właściwości. Korekcji pH dokonuje się za pomocą DCl lub NaOD. Większość widm dla oligo- i monosacharydów wykonuje się w pH neutralnym. Przy obserwacji amidowych grup NH stosuje się obniżone pH (pH 4-5), trzeba jednak bardzo uważać by nie doprowadzić do hydrolizy wiązań glikozydowych, występujących np. w fukozie, czy kwasie neuramidowym. Podczas obserwowania grup hydroksylowych należy próbę schłodzić (nawet do -20°C) by spowolnić proces wymiany H na D (Leeflang i Vliegenthart 1990), aby zapobiec zamarzaniu stosuje się dodatki CD3COCD3 (aceton) lub CD3OD (metanol).

    2. Substancje paramagnetyczne

    Obecność metali paramagnetycznych niekorzystnie wpływa na jakość widma. W celu pozbycia się tych substancji stosuję się kolumnę Chalex (Bio-Rad). Innym sposobem jest dodanie substancji chelatujących np. EDTA; zbyt duże ilości EDTA pogarszają otrzymywane widmo NMR.

    3. Zabezpieczenie przeciwbakteryjne

    Przy używaniu ciężkiej wody jako rozpuszczalnika nie istnieje potrzeba stosowania dodatkowych zabezpieczeń. Jeśli jednak stosuje się bufor fosforanowy to wskazane jest używanie 0,02% roztworu NaN3.

    4. Temperatura pomiaru

    Utrzymanie stabilnej temperatury jest bardzo ważne, gdyż częstość rezonansu jest zależna od temperatury. W większości pomiarów stosuje się temperaturę 300 K (27oC). Przy analizowaniu grup hydroksylowych należy utrzymywać temperaturę poniżej 273 K (0oC).

    5. Probówki do NMR

    Wskazane jest używanie jak najcieńszych próbówek o wysokiej jakości np. Wilmad 528 PP lub 535 PP. Przed użyciem probówki muszą być bardzo starannie umyte i wysuszone. Jeżeli w procesie mycia używało się acetonu to można wykorzystać ten fakt do kalibracji przyrządu, gdyż aceton daje pik w zakresie 2.225 ppm. Nie poleca się używania do mycia kwasu chromowego, gdyż chrom jest pierwiastkiem paramagnetycznym.

    6. Dwuwymiarowy NMR

    W ostatnim dziesięcioleciu rozwinęła się nowa technika NMR - NMR 2-D. Do najważniejszych "podtechnik" tej odmiany NMR należą:
    • HOHAHA
    • COSY
    • NOESY.

    7. Trójwymiarowy NMR

    Technika rzadko wykorzystywana przy analizie węglowodanów. Otrzymuje się ją poprzez połączenie dowolnych dwóch rodzai technik 2-D NMR.

    F. Chromatografia gazowa

    Chromatografia gazowa nadaje się bardziej do ilościowego oznaczania zawartości cukrów niż do określania ich struktury. Dzieje się tak z powodu braku gotowych wzorców w przypadku reszt oligosacharydowych. Gdy jednak dysponuje się glikozydem wzorcowym, to otrzymane widmo może jednoznacznie potwierdzić, czy analizowany cukier jest tej samej struktury.
    Aby było możliwe analizowanie węglowodanów za pomocą chromatografii gazowej należy wpierw przeprowadzić je w formy lotne. Dokonuje się tego poprzez metylację i acetylację grup hydroksylowych sacharydu.
    Techniki tej można używać do analizowania reszt O-glikozydowych jaki i N-glikozydowych. Wadą jest natomiast niszczenie próby, gdyż detekcji dokonuje się w detektorze płomieniowym. Techniki tej używa się również do określania składu monosacharydowego reszt oligosacharydowych i w tym wypadku jest techniką najczęściej stosowaną. Stosuje się też ją w połączeniu z innymi np.:
    • spektroskopią masową
    • analizą metylacyjną.

    G. Spektroskopia masowa (MS)

    W zależności od techniki jonizacji otrzymuje się informacje o masie molekularnej, w przypadku MALD/MS. Możliwe jest również otrzymanie informacji o strukturze, rodzaju rozgałęzień i wiązań w przypadku FAB-MS dzięki fragmentacji cząsteczki. We wszystkich rodzajach spektroskopii masowej analizowana próba ulega jonizacji za pomocą czynnika jonizującego i zostaje odchylona w zależności od swej masy w polu magnetycznym. Istnieje ścisłe powiązanie masy cząsteczki z odchyleniem od prostoliniowego toru lotu lub z czasem dotarcia do detektora w przypadku spektroskopów TOF.
    Jak do tej pory spektroskopia masowa pozwalająca na określenie budowy oligosacharydów była dopełnieniem analizy metylacyjnej. Ostatnio analiza metylacyjna jest jednak techniką coraz rzadziej stosowaną w przygotowaniu preparatów do spektroskopii masowej. Także FAB-MS jest techniką coraz rzadziej używaną w swej pierwotnej postaci. Intensywnie rozwijającą się techniką jest natomiast MALD-MS.

    1. Jonizacja w strumieniu elektronów (EI)

    Metoda jonizacji za pomocą strumienia elektronów, choć stara, bywa nadal powszechnie używana do wykrywania monosacharydów, szczególnie w połączeniu z chromatografią gazową (GC/MS) (Karlsson, Carlstedt i Hansson 1989). W technice tej stosuje się głównie takie pochodne, jak: metylowe, acetylowe i trimetylosilanowe w celu uczynienia próby lotną i termicznie stabilną. Pochodne trimetylosilanowe (TMS) są również użyteczne i w chromatografii cieczowo-gazowej (GLC), chociaż ich widma posiadają wiele pików dla cukrów redukujących w wyniku anomerycznej izomeryzacji i tworzenia postaci zarówno furanozowej, jak i piranozowej.

    a) GC/MS

    Połączenie chromatografii gazowej z spektrometrią masową pozwala na analizę wiązań pomiędzy resztami monosacharydowymi przy wcześniejszej ich metylacji. Jest to metoda od dawna używana do analizy reszt oligosacharydowych i często cytowana wraz z analizą metylacyjną, gdzie w celu zabezpieczenia wszystkich wolnych grup hydroksylowych poddaje się je przekształceniu w grupy metoksy i dalej doprowadza się do hydrolizy oligosacharydu w kwaśnym środowisku. Powstałe wolne monosacharydy są redukowane do alditoli, które są acetylowane na nowo powstałych resztach hydroksylowych. W wyniku jonizacji powstają z monosacharydów serie jonów, które zostały opisane przez Hellerqvist"a (Hellerqvist 1990). Metoda oznaczania anomerii wiązań została omówiona w punkcie odnoszącym się analizy metylacyjnej.

    2. Jonizacja chemiczna (CI)

    Jest to łagodniejsza odmiana jonizacji w stosunku do EI. Poza metodą jonizacji, dalsze oznaczanie jest takie samo jak EI, również i tu wykorzystuje się wcześniejszą metylację i acetylację; dodanie pentafluorobenzyl-p-aminobenzoesanu powoduje zwiększenie czułości i rozdzielczości (Ceasar, Sheeley, Reinhold 1990).

    3. FAB

    Metoda zaprezentowana po raz pierwszy w 1981 roku spowodowała rozszerzenie zakresu mas możliwych do analizowania w procesie spektrometrii masowej EI. W krótkim czasie została metodą wiodącą jeśli chodzi o analizowanie sekwencji i struktury rozgałęzień sacharydów. Jonizacji próby dokonuje się poprzez bombardowanie zawieszonej w glicerolu lub tioglicerolu analizy strumieniem neutralnych atomów, głównie argonu, lub ksenonu. Możliwe jest również użycie w tym celu jonów cezu (Dwek i wsp. 1993). Częściowa jonizacja metylowanej próby pozwala na otrzymanie widma mówiącego o sekwencji i strukturze reszt cukrowych.

    4. MALD-MS

    Technika pozwalająca na otrzymanie widma obrazującego masę białek, glykopeptydów i reszt oligosacharydowych w przeciągu kilkunastu minut. Aby przeprowadzać pomiar nie istnieje potrzeba tworzenia pochodnych oligosacharydów jak ma to miejsce w przypadku FAB-MS. Aby otrzymać widmo analiza jest najpierw mieszana z rozpuszczalnikiem, który zawiera substancję pochłaniającą promieniowanie UV.
    Mieszanina substancji pochłaniającej promieniowanie UV i analizy jest krystalizowana, a następnie poddawana we wnętrzu spektrometru masowego TOF pulsacyjnemu wzbudzeniu laserem. Zwykle w tym celu używany jest laser azotowy dający falę o długości 337 nm. Wzbudzony materiał daje jeden pik. Małe stężenia soli obecnych w próbie nie wpływają znacząco na wynik pomiaru. W celu fragmentacji próby poddaje się ją naświetleniu promieniowaniem z zakresu IR, np. otrzymanym dzięki laserowi CO2 (Martin i wsp 1989).

    5. Electrospray Mas Spectroscopy (ES-MS)

    W technice tej próba wraz z rozpuszczalnikiem jest rozpylana w polu elektrycznym o wysokim potencjale (kilkadziesiąt - kilkaset kV) co powoduje odparowanie rozpuszczalnika i jonizację próby. Z powodu wysokiego stopnia jonizacji stosunek masy do ładunku jest niski. Obecnie ES-MS używana jest do sprawdzania obecności glikozylacji w peptydach i glikopeptydach otrzymanych poprzez trawienie enzymatyczne.

    H. Analiza metylacyjna

    Miejsce wiązania pomiędzy monosacharydami w oligosacharydach może być określone na podstawie analizy metylacyjnej. Metylację wolnych grup hydroksylowych w cukrach uzyskuje się zwykle za pomocą karboanionu soli sodowej metylosulfinylu (Hakamori 1964). Istnieją także doniesienia o używaniu jako odczynnika metylującego karboanionu soli potasowej metylosulfinylu (Philips i Fraser 1981). Zmetylowane oligosacharydy poddaje się kwaśnej hydrolizie. Następnie działaniu NaBH4 i dalej acylacji bezwodnym kwasem octowym. Otrzymane w ten sposób metylowane monocukry rozdziela się i analizuje za pomocą chromatografii gazowej i spektroskopii masowej.

    1. Określanie anomerii

    Metoda polega na wykorzystaniu zjawiska różnej reaktywności wiązań - i -D-glikozydowych w procesie utleniania za pomocą CrO3 w środowisku kwasu octowego. Ponieważ wiązanie posiada dwa atomy tlenu umieszczone blisko siebie (pochodzące z pierścienia i wiązania glikozydowego) jest bardziej prawdopodobne, że ulegnie szybciej utlenieniu niż wiązanie . Dalsza analiza polega porównaniu składu sacharydu przed i po procesie utleniania za pomocą GC/MS. Obecność nieprzereagowanych cukrów sugeruje występowanie wiązania -glikozydowego (Hoffman, Lidberg, Svensson 1972).

    III. Wykaz najczęściej używanych skrótów

    ConA-lektyna z kanawalii mieczoksztaltnej (Canavalia ensiformis)
    D-deuter
    Da-dalton
    Fuc-fukoza
    Gal-galaktoza
    GalNAc-N-acetylogalaktozoamina
    Glc-glukoza
    GlcNAc-N-acetyloglukozoamina
    HPLC-High Performance Liquid Chromatography
    HPAEC-High Performance Anion Exchanege Chromatography
    IR-promieniowanie podczerwone
    Man-mannoza
    NeuAc-kwas N-acetyloneuraminowy
    SDS-sól sodowa kwasu dodesylosulfonowego
    Xyl-ksyloza

    IV. Literatura

    1. Bregh M.L.E., Koppen p. i van den Eijnden D.H. (1981) Carbohydr. Res., 94, 225
    2. Ceasar J.P.Jr., Sheeley D.M., Reinhold V.N. (1990) Anal. Biochem., 191, 247
    3. Dwek R.A. i wsp. (1993) Anu. Ev. Biochem., 62, 65
    4. El Rassi Z. i Mechref Y. (1996) Electrophoresis, 17, 275
    5. Endo Y. i Kobata A. (1976) J. Biochem., 80, 1
    6. Fan J.Q., Kadowaki S. i wsp. (1988), Argic. Biol. Chem., 52, 1715
    7. Fukuda M. i Kobata A. Glycobiology a practical approach (1993) Oxford University Press, New York, s. 91-99, s. 140
    8. Hakamori S. (1964) J. Biochem. (Tokyo), 55, 205
    9. Harris R.H. i Spellman M.W. Glycobiology, 3, 219
    10. Hellerqvist C.G. (1990) Methods Enzymol., 193, 554
    11. Hoffman J., Lidberg B., Svensson S. (1972)
    12. Iwase H. i wsp. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm., 151, 422
    13. Kakehi K. i wsp. (1994) J. Chromatogr. A, 680, 209
    14. Karlsson H., Carlstedt I. I Hansson G.C. (1989) Anal. Biochem., 182, 438
    15. Kłyszejko-Stefanowicz L. Cytobiochemia (1995), Wydawnictwa Naukowe PWN, Warszawa, s. 648
    16. Kobata A. (1992) Eur. J. Biochem., 209, 483
    17. Kobata A. (1994) katalog firmy Oxford GlycoSystems 1994, 3
    18. Krotkiewski H. (1982) Postępy Bioch., 28, 433
    19. Lee Y.C. (1996) J. Chromatogr. A, 720, 137
    20. Leeflang B.R. i Viegenthart J.F.G. (1990) J. Mag. Reson., 89, 615
    21. Leurage P. i Faye L. (1996) Plant Physiol. Biochem., 34 (2), 263.
    22. Likhosherstow i wps. (1990) Carbohydr. REs., 178, 155
    23. Lisman J.J.W i wsp. (1985) Biochem. J., 229, 379
    24. Maley F. i wsp. (1989) Jr., Anal. Biochem., 180, 195
    25. Maramatsu T. (1971) Journal of Chromatography, 246, 5535
    26. Maramatsu T. (1988) Meth. Enzymol., 50, 555
    27. Martin W.B. i wsp. (1989) Int. J. Mass Spektrom. Ion Proc., 92, 243
    28. O"Neill R.A. (1996) Journal of Chromatography A, 720, 201
    29. Ogawa H. i wsp. (1996) Glycoconjugate Jurnal 13, 555
    30. Patel T i wsp. (1993) Biochemistry, 32, 679
    31. Paulus A. i Klockow A (1996) Journal of Chromatography A, 720, 353
    32. Philips L.R. i Fraser B.A. (1981) Carbohydr. Res., 90, 149
    33. Plumer T.H. i wsp. (1981) J. Biol. Chem., 256, 10243
    34. Schacter H. (1986) Biochem. Cell. Biol., 64, 163
    35. Schacter H. (1994) katalog firmy Oxford GlycoSystems 1994, 9
    36. Stryer L., Biochemistry - czwarta edycja, (1995) W.H. Freeman and Company, New York, s. 56-57
    37. Tachibana Y., Yamashita K. i Kobata A. (1982) Biochem. Biophys., 214, 379
    38. Taga E.M. i wsp. (1984) Biochemistry, 23, 815
    39. Taverna M i wsp. (1995) Biomed. Chromatogr. B, 657, 315
    40. Townsend R.R. i Hardy M.R. (1991) Glycobiology, 1, 139
    41. Trimble R.B. i Tarentino A.L. (1991) J. Biol. Chem., 266, 1646
    42. Trimble R.B. i wsp. (1986) J. Biol. Chem., 261, 12000

    Praca wpłynęła na Chemfan: 12-06-1999

    Menu2