Menu1

Prace dyplomowe

Część doświadczalna

Materiały i metody.

Widma NMR rejestrowane były na spektrometrze Varian Unity 300 BB VT. Eksperymenty 31P NMR przeprowadzane były w temp 25° C w probówkach f 5 mm (0,6 ml) przy stężeniach związków zawierających fosfor wynoszących 0,1 mmol/ml. Widma masowe rejestrowano na spektrometrze JEOL MS SX 102 z wykorzystaniem alkoholu m-nitrobenzylowego jako matrycy i octanu sodu jako 1/4ródła jonów sodowych. Analizę elementarną przeprowadzano na aparacie Perkin Elmer 2400 CHN. Chromatografię cienkowarstwową przeprowadzałem na płytkach silica gel 60 F254 stosując następujące fazy rozwijające (v/v): A - chloroform-metanol 90:10; B1 - chloroform-izopropanol 95:5; B2 - chloroform-izopropanol 90:10; C - chloroform-metanol-trietyloamina 85:10:5; D - izopropanol-woda-25% woda amoniakalna 85:10:5. Wartości Rf są względne i odnoszą się do 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyny (fazy A i B) oraz 3'-H-fosfonianu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyny (fazy C i D).

Syntezę i modyfikację oligonukleotydów przeprowadzałem na zaprojektowanym i wykonanym w Pracowni Syntezy DNA IChB PAN w Poznaniu automatycznym syntetyzerze DNA. Oligonukleotydy analizowane i oczyszczane były na żelu poliakrylamidowym denaturującym (19% akrylamid, 1% N,N'-metylenobisakrylamid, 7M mocznik). Wizualizację oligomerów uzyskiwano poprzez umieszczenie żelu na płycie z fluoroforem i oświetlenie lampą UV 254 nm. Oligomery zawierające grupy fluoryzujące wizualizowano poprzez oświetlenie lampą UV 366 nm.
Pirydyna (Lab Scan) i acetonitryl (Merck) były przechowywane nad sitami molekularnymi 4A, aż zawartość wody obniżała się poniżej 20 ppm (miareczkowanie kulometryczne Karla-Fischera na kulometrze Metrohm 684 KF). Chlorek piwaloilu (Merck), 2-aminoetanol (Fluka), 3-aminopropan-1-ol (Aldrich) i glikol etylenowy (POCh) były przedestylowane przed użyciem. Trietyloamina (Loba) była przedestylowana i przechowywana nad wodorkiem wapnia (Fluka). Kwas fosforawy (Fluka), fosforyn dietylowy (Aldrich), fosforyn difenylowy (Aldrich), 4-aminobutan-1-ol (Merck), 5-amino-pentan-1-ol (Fluka), 6-aminoheksan-1-ol (Aldrich), 1,3-propanodiol (Fluka), 1,4-butanodiol (Fluka), 1,5-pentanodiol (Fluka), 1,6-heksanodiol (Fluka), jod (Merck), akrylonitryl (Loba) były używane bez oczyszczania. Etanol (POCh) był osuszony wg standardowej metody148 i przechowywany nad sitami molekularnymi 3A. n-Butyloamina (Fluka) osuszana była za pomocą KOH, następnie destylowana i przechowywana nad sitami molekularnymi 3A. H-Fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 121149, H-fosfonian etylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 146120, H-fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowy 147150, H-fosfonian 2-cyjanoetylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 148120, H-fosfonian p-chlorofenylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 173149 i 2-chloro-5,5-dimetylo-2-okso-1,3,2-dioksafosfinan (NEP-Cl) 133122 były przygotowane wg opublikowanych procedur.
Związki 134, 142, 143a, 163-165, 174 były nietrwałe, co uniemożliwiało ich oczyszczenie za pomocą chromatografii kolumnowej. Ich strukturę chemiczną wywnioskowałem z danych 31P NMR oraz przez porównanie ze związkami 134, 163, 164 i 174 zsyntetyzowanymi in situ poprzez kondensację odpowiedniego monoestru z butyloaminą lub aminoalkoholami 124a - c i e wobec NEP-Cl134. H-Fosfonodiestry były utleniane i izolowane jako stabilne fosforanodiestry. Związki referencyjne typu 165 otrzymane były poprzez transestryfikację151 H-fosfonianu difenylowego odpowiednimi aminoalkoholami.
Odparowywanie rozpuszczalników przed i po reakcjach przeprowadzane było zawsze pod zmniejszonym ciśnieniem.
Przesunięcia chemiczne i stałe sprzężeń 31P NMR produktów pośrednich i końcowych zestawiono w Tabeli 13 (str. *).

Otrzymywanie kwasu pirofosfonowego 120.
Kwas fosforawy (4 mM) odparowano z pirydyną, rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (10 ml) i dodano NEP-Cl lub chlorek piwaloilu (0,55 ekw.). Produkt 120 używano w postaci roztworu pirydynowego, w którym związek ten był trwały co najmniej trzy miesiące.

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - N-piwaloiloaminoalkilowych typu 126.
H-Fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy121 (sól trietyloamoniowa) i odpowiedni aminoalkohol (1 ekw.) wysuszono przez odparowanie z nadmiarem pirydyny i rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (1 mmol / 5 ml) a następnie dodano chlorek piwaloilu (2,5 ekw.). Po ok. 10' (TLC, faza A) dodano wodę (5%) i jod (1,05 ekw.). Utlenianie prowadzono przez 20'. Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem i odparowano rozpuszczalniki. Pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO3 aq. sat., fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano do sucha. Związki typu 126 izolowano za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu zawierającym 5% Et3N. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono nadmiarem heksanu - eteru dietylowego 1:1, po czym odsączono i wysuszono w próżni.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 2-(piwaloiloamino)etylowy 126a . Et3NH+. Wydajność 87%. A. E.: C: 62,1%, H: 7,1%, N: 6,1%, P: 3,6%; C44H61N4O11P zawiera C: 62,0%, H: 7,2%, N: 6,6%, P: 3,6%. Rf: 0,47 (faza C), 0,59 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,17 [9H, s, C(CH3)3], 1,31 [9H, t, J 7,3, N(CH2CH3)3], 1,35 (3H, s, 5-CH3), 2,33 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,03 [6H, q, J 7,3, N(CH2CH3)3], 3,38 (2H, m, CH2CH2NH), 3,49 (2H, m, 5'-H2), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,89 (2H, m, POCH2), 4,31 (1H, m, 4'-H), 4,98 (1H, m, 3'-H), 6,43 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,9, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,61 (1H, s, 6-H) i 8,84 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-(piwaloiloamino)propylowy 126b . Et3NH+. Wydajność 84%. S. M.: MH+: 867, (MH+ - Et3NH+)Na+: 788, (M - Et3NH+)2Na+: 810; C45H63N4O11P ma MH+: 867. Rf: 0,52 (faza C), 0,59 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,17 [9H, s, C(CH3)3], 1,32 (3H, s, 5-CH3), 1,32 [9H, t, J 7,3, N(CH2CH3)3], 1,70 (2H, dt, J 5,8, CH2CH2CH2), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,05 [6H, q, J 7,3, N(CH2CH3)3], 3,37 (2H, m, CH2CH2NH), 3,49 (2H, m, 5'-H2), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,86 (2H, m, POCH2), 4,31 (1H, m, 4'-H), 4,97 (1H, m, 3'-H), 6,43 (1H, m, 1'-H), 6,88 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H) i 8,86 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-(piwaloiloamino)heksylowy 126e . Et3NH+. Wydajność 72%. A. E.: C: 63,0%, H: 7,5%, N: 6,0%, P: 3,4%; C48H69N4O11P zawiera C: 63,4%, H: 7,6%, N: 6,2%, P: 3,4%. Rf: 0,52 (faza C), 0,59 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,18 [9H, s, C(CH3)3], 1,32 (3H, s, 5-CH3), 1,32 [9H, t, J 7,2, N(CH2CH3)3], 1,32 (4H, m, OCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH), 1,45 (2H, dt, J 6,9, CH2CH2CH2NH), 1,57 (2H, dt, J 6,9, POCH2CH2CH2), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH2CH3)3], 3,19 (2H, dt, J 6,6 i 6,9, CH2CH2NH), 3,37 (2H, m, CH2CH2NH), 3,40 (2H, m, 5'-H2), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,80 (2H, m, POCH2), 4,32 (1H, m, 4'-H), 5,78 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,9, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,61 (1H, s, 6-H) i 8,91 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-oksazaperhydrofosforinu 129b.

A. Metoda z preaktywacją H-fosfonianu nukleozydu 121.
Roztwór H-fosfonianu 121 w pirydynie (1 mmol/5 ml) aktywowano chlorkiem piwaloilu (2,5 ekw.). Następnie dodano 3-aminopropan-1-ol 124b (1,1 ekw.) i po 5' dodano jodu (1,05 ekw.). Po 15' nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano rozpuszczalnik a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i przemyto NaHCO3 aq. sat.. Fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano do sucha. Związek 130 oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono nadmiarem heksanu - eteru dietylowego 1:1. Osad odsączono i wysuszono w próżni. Wydajność 69%. S. M.: MH+: 664, (MNa)+: 686, (M - H+)2Na+: 708; C34H38N3O9P ma MH+: 664. Rf(dwa diastereoizomery): 0,58 i 0,62 (faza A), 0,58 i 0,66 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,73 (3H, s, 5-CH3), 1,65 i 2,00 (2H, 2m, CH2CH2CH2), 2,43 i 2,65 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,18 i 3,25 (2H, 2m, PNHCH2), 3,41 i 3,51 (2H, 2m, 5'-H2), 3,79 (6H, s, OCH3), 4,18 i 4,29 (2H, 2m, POCH2), 4,29 (1H, m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,47 (1H, m, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,81 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

B. Kondensacja wobec NEP-Cl.
H-Fosfonian 121 i 3-aminopropan-1-ol 124b (1,05 ekw.) w pirydynie (1 mmol/5 ml) traktowano chlorofosforanem 136 (2,5 ekw.) przez 10'. Następnie do roztworu dodano wody do stężenia 5% i mieszaninę utleniano jodem (1,05 ekw.) przez 15'. Dalszy przerób j.w. w metodzie A. Wydajność 66%. S. M.: MH+: 769, (MH+ - Et3NH+)Na+: 690, (M - Et3NH+)2Na+: 712; C39H53N4O10P ma MH+: 769. Rf: 0,22 (faza C), 0,37 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,30 [9H, t, J 7,3, N(CH2CH3)3] 1,34 (3H, s, 5-CH3), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,85 (2H, m, PNHCH2), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH2CH3)3], 3,49 (2H, m, 5'-H2), 3,53 (2H, m, CH2OH), 3,77 (6H, s, OCH3), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,91 (1H, m, 3'-H), 6,36 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H).

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-oksazaperhydrofosfepinu 129c.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 129b (podejście B), z tą różnicą, że użyto 4-aminobutan-1-ol 124c zamiast 3-aminopropan-1-olu 124b. Wydajność 53%. S. M.: MH+: 678, (MNa)+: 700, (M - H+)2Na+: 722; C35H40N3O9P ma MH+: 678. Rf (dwa diastereoizomery): 0,53 i 0,58 (faza A), 0,58 i 0,66 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,65 (3H, s, 5-CH3), 1,66 i 1,82 (4H, 2m, CH2CH2CH2CH2), 2,40 i 2,63 (2H, 2m, 2'-H2), 2,91 i 3,00 (2H, 2m, PNHCH2), 3,40 i 3,51 (2H, 2m, 5'-H2), 3,79 (6H, s, OCH3), 4,10 (1H, m, 4'-H), 4,08 i 4,20 (2H, 2m, POCH2), 5,17 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, dt, J 5,6, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,58 (1H, br s, 6-H) i 8,50 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Synteza amidofosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - N-(2-hydroksyetylowego) 130. Et3NH+.

A. Metoda z preaktywacją związku 121.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy perhydrofosforinu 129b (metoda A), z tą różnicą, że użyto 2-aminoetanol 124a zamiast 3-aminopropan-1-olu124b, a utlenianie prowadzono w obecności wody (0,5%). Produkt 130 oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu zawierającym 5% Et3N. Wydajność 57%.

B. Kondensacja wobec NEP-Cl.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy perhydrofosforinu 129b (metoda B), z tą różnicą, że użyto 2-aminoetanol 124a zamiast 3-aminopropan-1-olu124b. Oczyszczanie jw. Wydajność 69%. S. M.: MH+: 769, (MH+ - Et3NH+)Na+: 690, (M - Et3NH+)2Na+: 712; C39H53N4O10P ma MH+: 769. Rf: 0,22 (faza C), 0,37 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,30 [9H, t, J 7,3, N(CH2CH3)3] 1,34 (3H, s, 5-CH3), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,85 (2H, m, PNHCH2), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH2CH3)3], 3,49 (2H, m, 5'-H2), 3,53 (2H, m, CH2OH), 3,77 (6H, s, OCH3), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,91 (1H, m, 3'-H), 6,36 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H).

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 132b-e(metoda z wolnymi aminoalkoholami).
Odpowiednie diestry 134b-e otrzymano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 130 (metoda B). Po utlenieniu i rozłożeniu nadmiaru jodu etanotiolem, do mieszaniny reakcyjnej dodano NaHCO3 aq. sat. aby zneutralizować kwaśne składniki powstałe w toku reakcji. Rozpuszczalnik odparowano do gęstego oleju i rozpuszczono w minimalnej objętości chlorku metylenu zawierającego 5% Et3N. Nierozpuszczone sole nieorganiczne odsączono, a roztwór naniesiono na kolumnę zawierającą żel krzemionkowy. Rozdział przeprowadzono analogicznie jak dla związków typu 126.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-aminopropylowy 132b .Et3NH+. Wydajność 73%. S. M.: MH+: 682, (MNa+: 704, (M - H+)2Na+: 726; C34H40N3O10P ma MH+: 682. Rf: 0,02 (faza C), 0,18 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,32 (3H, s, 5-CH3), 1,88 (2H, m, POCH2CH2), 2,27 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,02 (2H, m, CH2NH3+), 3,33 (2H, m, 5'-H2), 3,72 (6H, s, OCH3), 3,89 (2H, 2m, POCH2), 4,20 (1H, m, 4'-H), 4,88 (1H, m, 3'-H), 6,27 (1H, m, 1'-H), 6,78 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,35 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,53 (1H, br s, 6-H).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 4-aminobutylowy 132c .Et3NH+. Wydajność 62%. S. M.: MH+: 696, (MNa+: 718, (M - H+)2Na+: 740; C35H42N3O10P ma MH+: 696. Rf: 0,03 (faza C), 0,15 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,35 (3H, s, 5-CH3), 1,62 (2H, m, CH2CH2NH3+), 1,79 (2H, m, POCH2CH2), 2,25 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,90 (2H, m, CH2NH3+), 3,30 (2H, m, 5'-H2), 3,72 (6H, s, OCH3), 3,79 (2H, 2m, POCH2), 4,23 (1H, m, 4'-H), 4,89 (1H, m, 3'-H), 6,29 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,36 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,55 (1H, br s, 6-H) i 8,30 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 5-aminopentylowy 132d .Et3NH+. Wydajność 78%. S. M.: MH+: 710, (MNa+: 732, (M - H+)2Na+: 754; C36H44N3O10P ma MH+: 710. Rf: 0,02 (faza C), 0,16 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,40 (3H, s, 5-CH3), 1,51 (2H, m, CH2CH2CH2CH2CH2), 1,59 (2H, m, CH2CH2NH3+), 1,71 (2H, m, POCH2CH2), 2,20 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,98 (2H, m, CH2NH3+), 3,34 (2H, m, 5'-H2), 3,75 (6H, s, OCH3), 3,79 (2H, 2m, POCH2), 4,25 (1H, m, 4'-H), 4,93 (1H, m, 3'-H), 6,29 (1H, m, 1'-H), 6,81 (4H, d, J 8,8, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,51 (1H, br s, 6-H) i 8,38 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowy 132e.Et3NH+. Wydajność 69%. S. M.: MH+: 724, (MNa+: 746, (M - H+)2Na+: 768; C37H46N3O10P ma MH+: 724. Rf: 0,05 (faza C), 0,19 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,32 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,33 (3H, s, 5-CH3), 1,54 (2H, m, CH2CH2NH3+), 1,67 (2H, m, POCH2CH2), 2,23 i 2,63 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,86 (2H, m, CH2NH3+), 3,30 (2H, m, 5'-H2), 3,70 (2H, 2m, POCH2), 3,73 (6H, s, OCH3), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,93 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,35 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,33 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 132a-e (metoda z preacylacją aminoalkoholi).
Odpowiedni aminoalkohol 124a-e (1,1 ekw.) potraktowano TFAA (1,1 ekw.) w pirydynie (aminoalkoholu). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór H-fosfonianu 121 w minimalnej ilości pirydyny, a następnie chlorek piwaloilu (3,0 ekw.). Po 10' dodano roztwór jodu (1,05 ekw.) w 20% wodnej pirydynie (5 ml/1 mmol H-fosfonianu 121). Po 15' rozłożono nadmiar jodu etanotiolem i zatężono roztwór do oleju, który następnie rozpuszczono w pirydynie (5ml/1 mmol H-fosfonianu 121) i dodano równą objętość 25% wodnego amoniaku. Reakcję pozostawiono na noc w temp. pok. Izolację fosforodiestrów 132a-e przeprowadzono tak, jak opisano powyżej dla 132b-e.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 2-aminoetylowy 132a.Et3NH+. Wydajność 88%. S. M.: MH+: 668, (MNa+: 690, (M - H+)2Na+: 712; C34H40N3O10P ma MH+: 668. Rf: 0,07 (faza C), 0,29 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,31 (3H, s, 5-CH3), 2,25 i 2,67 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,11 (2H, m, CH2NH3+), 3,31 (2H, m, 5'-H2), 3,69 (6H, s, OCH3), 4,03 (2H, 2m, POCH2), 4,20 (1H, m, 4'-H), 4,85 (1H, m, 3'-H), 6,20 (1H, m, 1'-H), 6,76 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,33 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,51 (1H, s, 6-H) i 8,06 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-aminopropylowy 132b . Et3NH+. Wydajność 82%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 4-aminobutylowy 132c . Et3NH+. Wydajność 73%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 5-aminopentylowy 132d . Et3NH+. Wydajność 81%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowy 132e . Et3NH+. Wydajność 80%. Dane spektralne i analityczne jw.

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 6-aminoheksylowego 132e . Et3NH+(metoda z kondensacją oksydatywną).
Mieszaninę diestru H-fosfonianowego 152 i tetrazolu (4 ekw.) oraz chlorowodorek 6-aminoheksan-1-olu 153e(10 ekw.) osuszonoosobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian z tetrazolem rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol 152 / ml) i dodano równocześnie chlorowodorek aminoalkoholu 153e w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Po zakończeniu reakcji syntezy triestru 155 (10') nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano pirydynę, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO3 aq. sat. i osuszono nad Na2SO4 bzw. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w pirydynie. Do roztworu dodano równą objętość 25% NH3 aq. i pozostawiono na noc w temp. pok. Roztwór następnie odparowano, a izolację fosforodiestru 132eprzeprowadzono tak, jak opisano na str. *. Wydajność 46%. Dane spektralne jak na str. *.

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-1,3,2-dioksafosfolanu 137a.
Roztwór H-fosfonianu 121 w pirydynie (1 mmol/5 ml) potraktowano chlorkiem piwaloilu (2,5 ekw.). Następnie dodano etanodiol 136a (1,1 ekw.), po 5' odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i przemyto krótko NaHCO3 aq. sat.. Fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano do sucha. Związek 137a oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując 0,5% metanolu w chlorku metylenu. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono w układzie heksan - eter dietylowy 1:1. Precypitat odfiltrowano i wysuszono w próżni. Wydajność 43%. Rf : 1,45 (faza B1). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,71 (3H, s, 5-CH3), 2,47 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,40 i 3,47 (2H, 2m, 5'-H2), 3,81 (6H, s, OCH3), 4,22 (2H, m, POCH2), 4,31 (1H, m, 4'-H), 5,08 (1H, m, 3'-H), 6,50 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,58 (1H, br s, 6-H) i 8,70 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Ogólna procedura otrzymywania cyklicznych fosforanów typu 139.

A. Metoda z preaktywacją związku 121.

 
B. Kondensacja wobec NEP-Cl.


Reakcje przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 129b (podejścia A i B), z tą różnicą, że używano dioli 136b - 136d zamiast 3-aminopropan-1-olu 124b.

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfinan 139b. Wydajność 63% (metoda A); 58% (metoda B). S. M.: MH+: 665, M+: 664; C34H37N2O10P ma MH+: 665. Rf: 1,33 (faza A), 1,38 (faza B2). 1H NMR, d H (CDCl3): 1,46 (3H, s, 5-CH3), 1,70 i 2,20 (2H, 2m, CH2CH2CH2), 2,50 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,49 (2H, m, 5'-H2), 3,75 (6H, s, OCH3), 4,29 (2H, m, POCH2), 4,33 (1H, m, 4'-H), 5,26 (1H, m, 3'-H), 6,56 (1H, m, 1'-H), 6,85 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,44 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,60 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfepan 139c. Wydajność 61% (metoda A); 68% (metoda B). S. M.: MH+: 680, M+: 679; C35H39N2O10P ma MH+: 680. Rf: 1,34 (faza A), 1,39 (faza B2). 1H NMR, d H (CDCl3): 1,41 (3H, s, 5-CH3), 1,89 (4H, m, CH2CH2CH2CH2), 2,43 i 2,62 (2H, 2m, 2'-H2), 3,47 (2H, m, 5'-H2), 3,76 (6H, s, OCH3), 4,13 (4H, m, POCH2), 4,30 (1H, m, 4'-H), 5,30 (1H, m, 3'-H), 6,54 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,27-7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,61 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfokan 139d. Wydajność 52% (metoda A); 45% (metoda B). S. M.: MH+: 694, M+: 693; C36H41N2O10P ma MH+: 694. Rf: 1,34 (faza A), 1,38 (faza B2). 1H NMR, d H (CDCl3): 1,41 (3H, s, 5-CH3), 1,73 (4H, m, POCH2CH2), 1,90 (2H, m, POCH2CH2CH2), 2,40 i 2,65 (2H, 2m, 2'-H2), 3,46 (2H, m, 5'-H2), 3,78 (6H, s, OCH3), 4,06 (4H, m, POCH2), 4,29 (1H, m, 4'-H), 5,22 (1H, m, 3'-H), 6,51 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,26-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,56 (1H, br s, 6-H) i 8,61 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 2-hydroksyetylowego 141a. Et3NH+.
Reakcję przeprowadzono analogicznie do opisanej wyżej syntezy amidofosforanu 130 (metoda A), z tą różnicą, że użyto glikolu etylenowego 136a zamiast 2-aminoetanolu 124a, a utlenianie prowadzono wobec 1,5 ekw. wody, a po zakończeniu utleniania ilość wody zwiększono do 10% v/v. Wydajność 41%. S. M.: MH+: 770, (MH+ - Et3N): 668; C39H52N3O11P ma MH+: 770. Rf: 0,31 (faza C), 0,41 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,31 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3] 1,35 (3H, s, 5-CH3), 2,36 i 2,67 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,06 [6H, q, J 7,2, N(CH2CH3)3], 3,42 (2H, m, 5'-H2), 3,70 (2H, t, J 4,2 CH2OH), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,94 (2H, m, POCH2), 4,30 (1H, m, 4'-H), 5,04 (1H, m, 3'-H), 6,41 (1H, m, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,60 (1H, br s, 6-H).

Ogólna procedura syntezy fosforanów typu 141.
Reakcję i oczyszczanie prowadzono analogicznie do opisanej wyżej syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych typu 132 (metoda z wolnymi aminoalkoholami), z tą różnicą, że zamiast aminoalkoholi typu 124 użyto dioli typu 136, a utlenianie prowadzono wobec 10% v/v wody.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 4-hydroksybutylowy 141c . Et3NH+. Wydajność 71%. Rf: 0,33 (faza C), 0,45 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,29 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3] 1,34 (3H, s, 5-CH3), 1,48 (2H, m, CH2CH2OH), 1,80 (2H, m, POCH2CH2), 2,39 i 2,49 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,11 [6H, q, J 7,2, N(CH2CH3)3], 3,34 i 3,45 (2H, m, 5'-H2), 3,57 (2H, t, J 4,1 CH2OH), 3,82 (6H, s, OCH3), 4,03 (2H, m, POCH2), 4,20 (1H, m, 4'-H), 5,01 (1H, m, 3'-H), 6,52 (1H, m, 1'-H), 6,78 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,22-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,65 (1H, br s, 6-H).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 5-hydroksypentylowy 141d. Et3NH+. Wydajność 75%. Rf: 0,38 (faza C), 0,50 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,29 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3], 1,39 (2H, m, CH2CH2CH2CH2CH2), 1,44 (3H, s, 5-CH3), 1,53 (2H, m, CH2CH2OH), 1,78 (2H, m, POCH2CH2), 2,38 i 2,46 (2H, 2 m, 2'-H2), 3,21 [6H, q, J 7,2, N(CH2CH3)3], 3,33 i 3,48 (2H, m, 5'-H2), 3,61 (2H, t, J 4,1 CH2OH), 3,78 (6H, s, OCH3), 4,10 (2H, m, POCH2), 4,22 (1H, m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,49 (1H, m, 1'-H), 6,73 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,66 (1H, br s, 6-H).

Ogólna metoda syntezy nukleozydowych pochodnych N-(2-cyjanoetylo)aminoalkilowych (147 i 149).
Do roztworu fosforanu 6-aminoheksylowo - tymidyn-3'-ylowego 146 lub N4-(6-aminoheksylo)-5-metylocytydyny 148 (0,5 mmola) w 10 ml wodnego roztworu amoniaku (25%) dodano 10 ekw. akrylonitrylu (5,0 mmola, 0,33 ml). Po zakończeniu reakcji (TLC, 15 min.) rozpuszczalnik i nadmiaru akrylonitrylu zostały odparowane pod zmniejszonym ciśnieniem. Fosfodiester 147 wyizolowano w postaci stałej poprzez rozpuszczenie pozostałości w metanolu i strącenie do eteru dietylowego, a nukleozyd 149 oczyszczono za pomocą krótkokolumnowej chromatografii na żelu krzemionkowym stosując liniowy gradient metanolu (0-20% w chlorku metylenu zawierającym 1% Et3N).

Fosforan tymidyn-3'-ylowo - N-(2-cyjanoetylo)-6-aminoheksylowy 147. NH4+. Wydajność 85%. Rf: 0,74 (faza D). 1H NMR, d3OD): 1,45 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,65 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,88 (3H, s, 5-CH3), 2,27 i 2,46 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,81 (2H, t, J 6,9, CH2CN), 2,85 (2H, t, J 7,2, CH2CH2CH2NH), 3,12 (2H, t, J 6,0, CH2CH2CN), 3,30 (2H, m, 5'-H2), 3,89 (2H, dt, JHH 6,0, JHP 6,5, POCH2), 4,15 (1H, m, 4'-H), 4,82 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 7,86 (1H, br s, 6-H).

N4-[N-(2-cyjanoetylo)-6-aminoheksylo]-5-metylocytydyna 149. Wydajność 86%. Rf: 0,43 (faza C). 1H NMR, d3OD): 1,51 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,60 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,96 (3H, s, 5-CH3), 2,15 i 2,26 (2H, 2 m, 2'-H2), 2,59 (2H, t, J 6,9, CH2CN), 2,63 (2H, t, J 6,9, CH2CH2CH2NHCH2), 2,86 (2H, t, J 7,5, CH2CH2CN), 3,36 (2H, t, J 7,5, CH2CH2CH2CH2CH2CH2NHCH2), 3,76 (2H, m, 5'-H2), 3,92 (1H, m, 4'-H), 4,39 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 7,75 (1H, br s, 6-H).

Synteza amidofosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - etylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 154. Diester H-fosfonianowy 150 i 6-aminoheksan-1-ol 124e osuszono osobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian 150 rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol / ml) i dodano równocześnie aminoalkohol 124e (10 ekw.) w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano rozpuszczalnik a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO3 aq. sat.. Fazę organiczną osuszono nad Na2SO4 bzw. i odparowano. Produkt 154 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (0-10% CH3OH w chlorku metylenu), frakcje zawierające czysty produkt zatężono, rozpuszczono w minimalnej ilości chlorku metylenu i strącono w układzie heksan-eter dietylowy 1:1. Osad odsączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 80%. A. E.: C: 62,0%, H: 6,7%, N: 5,8%. C39H50N3O10P zawiera C: 62,3%, H: 6,7%, N: 5,6%. M. S.: MH+: 753, M+: 752. C39H50N3O10P ma MH+: 753. Rf (dwa diastereoizomery): 0,70 i 0,79 (faza A); 0,71 i 0,81 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,20 i 1,32 (3H, 2dt, 3JHH 6,9, 4JPH 0,6, CH2CH3), 1,36 (4H, m, PNHCH2CH2CH2CH2CH2CH2OH), 1,38 (3H, s, CH3), 1,44 (2H, m, NHCH2CH2), 1,54 (2H, m, CH2CH2OH), 2,41 i 2,63 (2H, 2m, 2'-H2), 2,86 (2H, m, NHCH2), 3,42 (2H, m, 5'-H2), 3,52 (2H, m, CH2OH), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,97 i 4,06 (2H, q i dq, 3JHH 7,2 i 7,3, 3JPH 1,2, POCH2), 4,26 i 4,30 (1H, 2m, 4'-H), 5,11 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23 - 7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,59 i 7,61 (1H, 2s, 6-H).

Synteza amidofosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 155. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono analogicznie jak dla amidu 154, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 151. Wydajność 53%. A. E.: C: 68,2%, H: 6,1%, N: 6,0%. C64H68N5O12P zawiera C: 68,0%, H: 6,1%, N: 6,2%. Rf (dwa diastereoizomery): 0,83 i 0,91 (faza A); 0,80 i 0,89 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,22 (4H, m, PNHCH2CH2CH2CH2CH2CH2OH), 1,29 i 1,41 (2H, 2m, PNHCH2CH2), 1,35 i 1,38 (3H, 2s, CH3(3'T)), 1,48 (2H, m, CH2CH2OH), 1,65 i 1,90 (2H, 2m, 2'(5'T)-H2), 1,83 (3H, s, CH3(5'T)), 2,39 i 2,49 (2H, 2m, 2'(3'T)-H2), 2,65 i 2,78 (2H, 2m, PNHCH2), 3,40 (2H, m, 5'(3'T)-H2), 3,56 (2H, m, CH2OH), 3,65 (2H, m, 5'(5'T)-H2), 3,73 (6H, 2s, OCH3(5'T)), 3,73 - 3,76 (6H, 4s, OCH3(3'T)), 3,92 i 3,97 (1H, 2m, 4'(5'T)-H), 4,13 i 4,18 (1H, 2m, 4'(3'T)-H), 4,26 (1H, m, 3'(5'T)-H), 5,07 (1H, m, 3'(3'T)-H), 6,33 (1H, m, 1'(5'T)-H), 6,41 (1H, m, 1'(3'T)-H), 6,82 (8H, m, 3, 3', 5, 5'-H z grup DMTr), 7,17 - 7,37 (18H, m, ArH z grup DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,22 i 7,30 (1H, 2s, 6(5'T)-H), 7,52 i 7,60 (1H, 2s, 6(3'T)-H).

Synteza fosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowo - etylowego 157. Diester H-fosfonianowy 150 i chlorowodorek 6-aminoheksan-1-olu 153e (10 ekw.) osuszonoosobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian 150 rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol / ml) i dodano równocześnie chlorowodorek aminoalkoholu 153e w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Po zakończeniu reakcji (10') nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano pirydynę, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO3 aq. sat. i osuszono nad Na2SO4 bzw.Produkt 157 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (5% v/v NH3 aq. 25% w n-propanolu), frakcje zawierające czysty produkt zatężono i zliofilizowano z zestalonego benzenu. Wydajność 64%. A. E.: C: 61,9%, H: 6,8%, N: 5,4%. C39H50N3O10P zawiera C: 6 ,3%, H: 6,7%, N: 5,6%. Rf (dwa diastereoizomery): 1,12 i 0,97 (faza A); 1,10 i 0,95 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,27 i 1,32 (3H, 2dt, 3JHH 7,2, 4JPH 1,2, CH2CH3), 1,36 (4H, m, POCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2), 1,39 (3H, s, CH3), 1,49 (2H, m, CH2CH2NH2), 1,66 (2H, m, POCH2CH2), 2,40 (2H, m, CH2NH2), 2,62 i 2,72 (2H, 2m, 2'-H2), 3,45 (2H, m, 5'-H2), 3,79 (6H, s, OCH3), 4,00 (2H, m, POCH2CH2), 4,10 (2H, m, POCH2CH3), 4,27 i 4,29 (1H, 2m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25 - 7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, s, 6-H).

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowego 158. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono analogicznie jak dla fosforanu 157, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 151. Wydajność 53%. A. E.: C: 68,3%, H: 6,1%, N: 6,1%. C64H68N5O12P zawiera C: 68,0%, H: 6,1%, N: 6,2%. Rf (dwa diastereoizomery): 1,28 i 1,20 (faza A); 1,30 i 1,22 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,27 (4H, m, POCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2), 1,36 i 1,37 (3H, 2s, CH3(3'T)), 1,53 (2H, m, CH2CH2NH2), 1,55 (2H, m, POCH2CH2), 1,68 i 1,92 (2H, 2m, 2'(5'T)-H2), 1,82 I 1,85 (3H, 2s, CH3(5'T)), 2,39 i 2,57 (2H, 2m, 2'(3'T)-H2), 2,76 (2H, m, CH2NH2), 3,35 i 3,47 (2H, 2m, 5'(3'T)-H2), 3,65 (2H, m, 5'(5'T)-H2), 3,73 (6H, 2s, OCH3(5'T)), 3,74, 3,76 i 3,77 (6H, 3s, OCH3(3'T)), 3,83 (2H, m, POCH2), 3,95 (1H, m, 4'(5'T)-H), 4,09 i 4,19 (1H, 2m, 4'(3'T)-H), 4,25 (1H, m, 3'(5'T)-H), 5,10 (1H, m, 3'(3'T)-H), 6,37 (1H, m, 1'(5'T)-H), 6,46 (1H, m, 1'(3'T)-H), 6,83 (8H, m, 3, 3', 5, 5'-H z grup DMTr), 7,22 - 7,34 (18H, m, ArH z grup DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,22 (1H, 2s, 6(5'T)-H), 7,51 i 7,56 (1H, 2s, 6(3'T)-H).

Synteza amidofosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 160. Et3NH+. Syntezę przeprowadzono analogicznie jak dla amidu 154, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 152, a utlenianie prowadzono w acetonitrylu. Po zakończeniu reakcji odparowano acetonitryl, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO3 aq. sat. i osuszono nad Na2SO4 bzw.. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w pirydynie. Do roztworu dodano równą objętość 25% NH3 aq. i pozostawiono na noc w temp. pok. Roztwór następnie odparowano i związek 160 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (0-15% CH3OH w chlorku metylenu zawierającym 1% Et3N). Frakcje zawierające czysty produkt zatężono, rozpuszczono w minimalnej ilości chlorku metylenu i strącono w układzie heksan-eter dietylowy 1:1. Osad odsączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 54%. A. E.: 64,6%, H: 7,4%, N: 7,2%. C41H57N4O8P zawiera C: C: 64,4%, H: 7,5%, N: 7,3%. Rf: 0,32 (faza C), 0,47 (faza D). 1H NMR, dH (CDCl3): 1,30 (6H, m, PNHCH2CH2CH2CH2CH2CH2OH), 1,34 (3H, s, CH3), 1,36 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3], 1,50 (2H, m, CH2CH2OH), 2,35 i 2,64 (2H, 2m, 2'-H2), 2,77 (2H, m, NHCH2), 3,09 [6H, q, J 7,5, N(CH2CH3)3], 3,44 (2H, m, 5'-H2), 3,56 (2H, t, J 6,3, CH2OH), 3,77 (6H, s, OCH3), 4,26 (1H, m, 4'-H), 4,94 (1H, m, 3'-H), 6,39 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,60 (1H, s, 6-H).

Synteza amidofosfonianu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-ylowo - N-butylowego 162. H-Fosfonian nukleozydowo - arylowy 177 (0,5 mmola) traktowany był butyloaminą (0,25 ml, 2,5 mmola) w pirydynie (5 ml) przez 5'. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono chlorkiem metylenu (10x) i przemyto NaClaq. sat. Faza organiczna została osuszona nad bezwodnym Na2SO4 i odparowana do gęstego oleju. Zanieczyszczenia polarne oddzielono od produktu 162 poprzez szybkie sączenie na kolumnie z żelem krzemionkowym (związek 162 jest częściowo nietrwały podczas chromatografii co jest przyczyną jego niskiej wydajności po oczyszczeniu). Jako fazę wymywającą stosowano chlorek metylenu z metanolem (10%). Odpowiednie frakcje połączono, odparowano, rozpuszczono w chlorku metylenu. Produkt 162 wydzielono przez wytrącenie do heksanu i po odsączeniu wysuszono w próżni. Wydajność 25%. A. E.: C: 63,2%, H: 6,2%, N: 6,3%; C35H42N3O8P zawiera C: 63,3%, H: 6,4%, N: 6,3%. Rf: 1,16 (faza A), 1,34 (faza B2). 1H NMR, dH (CDCl3): 0,88 i 0,92 (3H, 2t, J 7,2 i 7,5, CH2CH3CH3)1,24-1,51 (4H, m, CH2CH2CH2CH3), 1,39 i 1,41 (3H, 2s, 5 - CH3), 2,43 i 2,57 (2H, m, 2'-H2), 2,80 i 2,89 (2H, m, NHCH2CH2), 3,38 i 3,52 (2H, m, 5'-H2), 3,79 (6H, s, OCH3), 4,24 (1H, m, 4'-H), 5,16 (1H, m, 3'-H), 5,83 i 7,99 (1H, 2d, J 646,8 i 648,6, PH), 6,46 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24 - 7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,56 i 7,58 (1H, 2s, 6-H), 8,6 (1H, br m, NH, wymiana z D2O);

Ogólna procedura syntezy H-fosfonianów bis(aminoalkilowych) (chlorowodorków) typu 165. Fosforyn difenylowy rozpuszczony w acetonitrylu (1 mmol / ml) traktowany był aminoalkoholem (2 ekw.) w ciągu 5'. Przez roztwór przepuszczano następnie gazowy bezwodny chlorowodór i produkt typu 165 (monochlorowodorek, jak stwierdzono na podstawie ilości strąconego AgCl po dodaniu wodnego roztworu AgNO3) wytrącał się w postaci gęstego oleju. Roztwór zdekantowano, pozostały olej przemyto acetonitrylem, rozpuszczono w minimalnej ilości DMSO i strącono w acetonitrylu (nadmiar 10x) uzyskując czysty produkt typu 165, ponownie jako gęsty olej. Po zdekantowaniu rozpuszczalnika pozostały olej przemyto acetonitrylem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

H-fosfonian bis(2-aminoetylowy) (chlorowodorek)165a. Wydajność 33%. S. M.: MH+: 169. C4H14N2O3PCl ma (M+ - Cl): 169; 1H NMR, d3)2SO]: 3,11 (4H, bm, CH2NH3+), 4,31 (4H, m, POCH2), 5,81 i 8,23 (1H, d, J 720,6, HP).

H-fosfonian bis(2-aminopropylowy) (chlorowodorek) 165b. Wydajność 43%. S. M.: MH+: 197. C6H18N2O3PCl ma (M+ - Cl): 197; 1H NMR, d3)2SO]: 1,96 (4H, m, CH2CH2CH2), 2,87 (4H, t, J 7,2, CH2NH3+), 4,12 (4H, m, POCH2), 5,73 i 8,08 (1H, d, J 705,3, HP).

H-fosfonian bis(2-aminobutylowy) (chlorowodorek)165c. Wydajność 45%. S. M.: MH+: 225. C8H22N2O3PCl ma (M+ - Cl): 225; 1H NMR, d3)2SO]: 1,45 (4H, m, CH2CH2NH3+), 1,60 (4H, m, POCH2CH2), 2,79 (4H, m, CH2NH3+), 4,02 (4H, m, POCH2), 5,71 i 8,04 (1H, d, J 697,2, HP).

H-fosfonian bis(2-aminoheksylowy) (chlorowodorek)165e. Wydajność 32%. S. M.: MH+: 281. C10H26O3N2PCl ma (M+ - Cl): 281; 1H NMR, d3)2SO]: 1,33 (8H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,59 (8H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 2,74 (4H, t, J 7,5, CH2NH3+), 4,00 (4H, m, 5,67 i 7,99 (1H, d, J 694,5, HP).

Ogólna procedura syntezy H-fosfonianów aminoalkilowych typu 173. Do roztworu fosforynu difenylowego (4,2 ml, 20 mmoli) w acetonitrylu (250 ml) dodano aminoalkohol typu 124 (40 mmoli). Po 15' dodano wody (1 ml, 55,5 mmola) i mieszaninę pozostawiono w temp. pok. na 5 dni. Wytrącone białe kryształy produktu 173 zebrano, przemyto dwukrotnie eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

H-Fosfonian 5-aminopentylowy 173d. Wydajność 79%. 1H NMR, d2O): 1,49 (2H, m, CH2CH2CH2), 1,67 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2), 3,03 (2H, t, J 7,2, CH2NH3+), 3,80 (2H, dt, JHH 6,8, JHP 8,3, POCH2), 6,74 (1H, d, J 631,9, HP).

H-Fosfonian 6-aminoheksylowy 173e. Wydajność 71%. 1H NMR, d2O): 1,41 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,64 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 2,99 (2H, t, J 7,3, CH2NH3+), 3,86 (2H, dt, JHH 6,6, JHP 8,4, POCH2), 6,70 (1H, d, J 632,6, HP).

H-Fosfonian 2-(2-aminoetoksy)etylowy 173f. Wydajność 83%. 1H NMR, d2O): 3,21 (2H, t, J 4,9 CH2NH3+), 3,74 (2H, t, J 4,5, POCH2CH2), 3,79 (2H, t, J 5,1, CH2CH2NH3+), 4,01 (2H, m, POCH2), 6,74 (1H, d, J 639,2, HP).

Synteza fosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo-tymidyn-5'-ylowo - 2-aminoetylowego 176a. Et3NH+. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono wg opisanej powyżej procedury otrzymywania fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 139a-e (metoda z preacylacją aminoalkoholi, str. *). Wydajność 0,15 g (45%). A. E.: C: 57,2%; H: 6,0%; N: 6,1%. C33H38N3O10P x 1,5 H2O zawiera C: 57,0%; H: 6,0%; N: 6,1%); Rf: 0,23 (faza C), 0,56 (faza D); 1H NMR, dH (CDCl3): 1,71 (3H, s, CH3), 1,73 (2H, m, 2'-H2), 2,98 (2H, m, CH2NH3+), 3,53 (2H, m, POCH2), 3,70 (6H, s, OCH3), 3,83 (2H, m, 4'-H), 4,31 (1H, m, 3'-H), 6,18 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d J 7,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18 - 7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,44 (1H, s, 6-H), 8,26 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Ogólna procedura syntezy fosforanowych diestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 176b, c, e.Syntezę przeprowadzono wg opisanej procedury otrzymywania fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 139b-e (metoda z wolnymi aminoalkoholami, str. *).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3-aminopropylowy 176b . Et3NH+. Wydajność 78%. A. E.: C: 57,6%; H: 6,0%; N: 6,0%. C34H40N3O10P x 1,5 H2O zawiera C: 57,6%; H: 6,1%; N: 5,9%); Rf: 0,13 (faza C), 0,34 (faza D); 1H NMR, dH (CDCl3): 1,78 (3H, s, CH3), 1,88 (2H, m, 2'-CH2), 1,98 (2H, m, POCH2CH2), 2,98 (2H, m, CH2NH3+), 3,54 (2H, m, POCH2), 3,73 (6H, s, OCH3), 3,78 (2H, m, 5'-H2), 3,85 (1H, m, 4'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d, J 8,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18 - 7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,44 (1H, s, 6-H), 8,26 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 4-aminobutylowy 176c . Et3NH+. Wydajność 85%. A. E.: C: 58,3%; H: 6,2%; N: 5,7%. C35H42N3O10P x 1,5 H2O zawiera C: 58,2; H: 6,3%; N: 5,8%); Rf 0,18 (faza C), 0,30 (faza D); 1H NMR, d3) 1,61 (2H, m, CH2CH2NH3+), 1,75 (2H, m, POCH2CH2), 1,80 (2H, m, 2'-H2), 1,81 (3H, s, CH3), 2,86 (2H, m, CH2NH3+), 3,51 (2H, m, POCH2), 3,74 (6H, s, OCH3), 3,78 (2H, m, 5'-H2), 3,93 (1H, m, 4'-H), 4,32 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,17 - 7,46 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,48 (1H, s, 6-H), 8,21 (1H, br s, N3H, wymiana z D2O).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 6-aminoheksylowy 176e. Et3NH+. Wydajność 51%. A. E.: C: 58,9%; H: 6,6%; N: 5,7%. C37H46N3O10P x 1,5 H2O zawiera C: 59,2%; H: 6,6%; N: 5,6%); Rf: 0,17 (faza C), 0,41 (faza D); 1H NMR, dH (CDCl3) 1,36 (4H, m, POCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH3+), 1,48 (2H, m, CH2CH2NH3+), 1,61 (2H, m, POCH2CH2), 1,75 (2H, m, 2'-H2), 1,82 (3H, s, CH3), 2,81 (2H, m, CH2NH3+), 3,52 (2H, m, POCH2), 3,65 (2H, m, 5'-H2), 3,78 (6H, s, OCH3), 3,88 (1H, m, 4'-H), 4,31 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,15 - 7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,53 (1H, s, 6-H).

Synteza H-fosfonianu 2-cyjanoetylowego 180. Do roztworu 2-cyjanoetanolu (20 mmoli, 1,36 ml) w pirydynie (5 ml) dodano fosforyn difenylowy (10 mmoli, 2,1 ml). Po 10' dodano 25% wodny roztwór amoniaku (15 ml), wymieszano do uzyskania homogeniczności i pozostawiono na 10'. Mieszaninę rozpuszczalników odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a resztę wody usunięto przez odparowanie dodanego toluenu. Pozostałość roztarto z Et2O (3 x 20 ml) dla usunięcia fenolu i nadmiaru alkoholu. Powstały biały krystaliczny osad produktu 179 odfiltrowano, przemyto Et2O i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 82%. 1H NMR, d H (D2O): 2,68 (2H, t, J 6,2, CH2CN), 3,90 (2H, dt, JHH 6,2, JHP 8,4, POCH2), 6,61 (1H, d, J 640,8, PH).

Ogólna procedura syntezy N-dimetoksytrytylowanych H-fosfonianów aminoalkilowych typu 182. Odpowiedni H-fosfonian aminoalkilowy 173 (5 mmoli) i DBU (10 mmoli, 1,50 ml) odparowano dwukrotnie z pirydyną i pozostałość rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku. Następnie dodano DMTr-Cl (6 mmoli, 2,03 g) i mieszaninę pozostawiono na noc. Po standardowym przerobie z wodnym roztworem NaHCO3 i chromatografii na żelu krzemionkowym (0-10% metanolu w CH2Cl2-Et3N 99 : 1 v/v), produkt 182 został wyizolowany i zliofilizowany z zestalonego benzenu.

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-aminopentylowy 182d. Et3NH+. Wydajność 81%. 1H NMR, d3Cl): 1,25 (2H, m, CH2CH2CH2), 1,31 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3], 1,56 (2H, m, POCH2CH2), 1,75 (2H, m, NHCH2CH2), 2,38 (2H, m, NHCH2), 3,00 [6H, q, J 7,5, N(CH2CH3)3], 3,72 (2H, dt, J 8,1, POCH2), 6,55 (1H, d, J 626,1, HP), 6,83 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,16-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-6-aminoheksylowy 182e. Et3NH+. Wydajność 74%. 1H NMR, d3Cl): 1,23 (4H, m, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1,30 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3], 1,54 (2H, m, POCH2CH2), 1,72 (2H, m, NHCH2CH2), 2,40 (2H, m, NHCH2), 3,04 [6H, q, J 7,5, N(CH2CH3)3], 3,71 (2H, dt, J 8,1, POCH2), 6,58 (1H, d, J 628,1, HP), 6,82 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-2-(2-aminoetoksy)etylowy 182f. Et3NH+. Wydajność 89%. 1H NMR, d3Cl): 1,27 [9H, t, J 7,5, N(CH2CH3)3], 2,37 (2H, bs, NHCH2), 2,99 [6H, q, J 7,5, N(CH2CH3)3], 3,43 (2H, bs, POCH2CH2), 3,54 (2H, bs, NHCH2CH2), 3,79 (2H, bs, POCH2), 6,61 (1H, d, J 625,1, HP), 6,75 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,10-7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

Protokół fosfonylacji oligonukleotydów typu I do 5'-H-fosfonianów oligonukleotydów typu II.

A. Metoda z użyciem kwasu pirofosfonowego.
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Kondensacja: 0,2M H4P2O5 w Py
4x100 
120
 3. Przemycie CH3CNa
8x100
1
 4. Utlenienie: 3% I2 w Py-H2O 9:1a
2x100
10
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Suszenie  
3
a Tylko dla oligomeru otrzymanego metod
a Tylko dla oligomeru otrzymanego metodą H-fosfonianową

B. Metoda z użyciem fosforynu difenylowego.
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Transestryfikacja: 0,5M (PhO)2P(O)H w Py
100 
5
 3. Przemycie CH3CN
2x100
0,25
 4. Hydroliza: 10% H2O w Py
2x100
30
 5. Przemycie CH3CNa
8x100
1
 6. Utlenienie: 3% I2 w Py-H2O 9:1a
2x100
10
 7. Przemycie CH3CN
8x100
1
 8. Suszenie  
3
a Tylko dla oligomeru otrzymanego metod
a Tylko dla oligomeru otrzymanego metodą H-fosfonianową

Protokół funkcjonalizacji oligonukleotydów typu I do 5'-aminoalkilofosforanów oligonukleotydów typu VI.

A. Podejście z kondensacją wobec NEP-Cl.
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Kondensacja: 0,2M H4P2O5 w Py
4x100 
120
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Kondensacja: 0,2M chlorowodorek aminoalkoholu w Py (40 m l), następnie 0,3M NEP-Cl w Py (80m l)
2x120 
4
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Utlenienie: 3% I2 w Py-H2O 9:1
2x100
10
 7. Przemycie CH3CN
8x100
1
 8. Suszenie  
3

B. Podejście z fosforynem difenylowym
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Transestryfikacja: 0,5M (PhO)2P(O)H w Py
100 
5
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Transestryfikacja: 0,2M chlorowodorek aminoalkoholu w Py
2x100
60
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Utlenienie: 3% I2 w Py-H2O 9:1
2x100
10
 7. Przemycie CH3CN
8x100
1
 8. Suszenie  
3

C. Podejście z kondensacją oksydatywną (wersja z H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym)
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Kondensacja: 0,2M H-fosfonian 2-cyjanoetylowy w Py (40 m l), następnie 0,3M Piv-Cl w Py (80m l)
2x120 
10
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Utlenienie: 3% I2, 0,2M chlorowodorek aminoalkoholu, 0,5M tetrazol w Py
2x100
10
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Suszenie  
3

D. Podejście z kondensacją oksydatywną (wersja z fosforynem difenylowym)
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Transestryfikacja: 0,5M (PhO)2P(O)H w Py
100 
5
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Transestryfikacja: 0,2M 2-cyjanoetanol w Py
2x100
60
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Utlenienie: 3% I2, 0,2M chlorowodorek aminoalkoholu, 0,5M tetrazol w Py
2x100
10
 7. Przemycie CH3CN
8x100
1
 8. Suszenie  
3

E. Podejście z syntonem nienukleotydowym
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Kondensacja: 0,2M H-fosfonian DMTr-aminoalkilowy w Py (40 m l), następnie 0,3M Piv-Cl w Py (80m l)
2x120 
1,5
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Przemycie chlorkiem etylenu
2x100
0,25
 5. Odtrytylowanie: 3% DCA w chlorku etylenu
12x100
3
 6. Przemycie chlorkiem etylenu
8x100
1
 7. Suszenie  
3

Protokół przyłączania grup reporterowych do sfunkcjonalizowanych oligonukleotydów typu VI na podłożu stałym.
 

Lp.
Funkcja
Objętość [ml]
Czas [min]
 1. Przemycie CH3CN
8x100
1
 2. Przemycie 10% DBU w Py
2x100
5
 3. Przemycie CH3CN
8x100
1
 4. Przyłączenie znacznika: 0,03M roztwór w Py (w reakcjach uwalniających produkty kwasowe - w obecności 3% DBU)
2x100 
30
 5. Przemycie CH3CN
8x100
1
 6. Suszenie  
3

 

Tabela 13. Przesunięcia chemiczne i stałe sprzężeń 31P NMR produktów przejściowych i końcowych


Związek
Przesunięcie chemicznead
1JPH [Hz]
3JPH [Hz]
120
-6,80b
652,6
-
121
2,89c
628,5
9,3
122
1,15d
736,1
-
123
4,90; 6,31e
724,8; 723,9 
8,3; 9,3
125a
8,36; 8,47f
706,8
11,0; 9,7
125b
8,26; 8,30f
706,3
9,3; 7,4
125e
7,67; 7,75f
701,9
9,7; 8,5
126a
0,22g
-
8,6; 7,3
126b
0,72g
-
9,5; 8,3
126e
-0,31g
-
7,3; 6,1
127
123,29d
-
9,2
128a
138,02; 138,07h
-
?
128b
134,04; 134,75h
-
?
129a
26,20h
-
?
129b
3,70; 3,73h
-
?
129c
14,87; 14,98h
-
?
130
8,18h
-
?
132a
0,87g
-
6,5
132b
0,41g
-
5,4
132c
-0,50g
-
7,4
132d
-0,47g
-
5,5; 7,4
132e
-0,46g
-
7,4
133
3,34i
-
27,8
134a
8,47; 8,81f
719,2; 738,9
7,4
134b
8,20; 8,40f
710,0; 711,8
7,4; 9,4
134c
7,88; 8,00f
704,4; 706,3
9,3
134d
7,82; 7,96f
702,6; 704,4
7,4
134e
7,77; 7,91f
704,4
9,3
135b
-13,10; -13,25; -13,45; -13,60h
-
?
135c
-13,09; -13,25; -13,34; -13,45h
-
?
135d
-13,07; -13,18; -13,31; -13,42h
-
?
135e
-13,09; -13,25; -13,34; -13,45h
-
?
137a
134,40j
-
8,7
137b
129,52j
-
9,2
137c
132,10k
-
9,3
137d
131,95l
-
8,3
138c
138,85h
-
?
138d
138,95l
-
7,4
139a
16,78k
-
8,6
139b
-8,37h
-
?
139c
2,16m
-
4,7; 17,6
139d
1,79l
-
6,4; 5,6; 5,5; 6,6; 4,6; 6,6
140c
1,43h
-
?
140d
1,50l
-
7,4
141a
1,71h
-
?
141c
0,44j
-
7,4
141d
0,44j
-
5,6
142a
8,56n
714,7
7,6
142b
7,97; 8,02m
703,5
8,4
142c
7,72m
701,7
5,5; 7,4
142d
7,70; 7,75m
701,1
6,0; 7,7
143a
23,10m
715,6
10,4
144a
6,12o
628,4
9,7
145
8,81m
694,3
9,2
147
0,15j, p
-
6,8
150
7,44; 7,50r
704,5
8,3
151
8,11; 9,47r
714,7; 715,5
8,4
152
7,72; 7,74r
718,4
2,8
154
10,16; 10,27l
-
8,4
155
10,08; 10,20l
-
8,3
156
10,41; 10,86h
-
?
157
-1,90; -2,08l
-
7,4
158
-1,62; -1,81h
-
?
159
-1,17; -1,31h
-
?
160
7,73j (6,89s)
-
7,4
161
7,54m
685,9
9,3
162
13,21; 13,34m
638,6; 640,5
11,2
163
12,96m
618,8
10,2
164a
8,44m
692,4
9,3
164b
8,02m
687,7
9,2
164c
7,83m
687,7
9,2
164e
7,86m
686,8
9,2
165a
9,21m
698,9
8,8
165b
8,44m
688,7
8,4
165c
8,10m
686,8
8,3
165e
8,13m
686,9
8,3
168
7,94m
693,4
9,3
171
2,57o
606,1
8,4
172a
8,29m
698,9
8,3
172b
8,37t
705,8
?
172c
8,15t
?
?
172e
8,16t
?
?
173a
6,70o, u
643,7
8,7
173b
6,46o, u
637,8
8,0
173c
6,42o, u
634,0
8,3
173d
6,43o, u
633,2
8,0
173e
6,42o, u
633,2
8,6
173f
6,60o, u
640,1
8,6
174a
9,13; 10,04r
707,1; 706,3
8,4
174b
8,71; 9,64r
688,7; 699,7
8,4
174c
8,47; 9,43r
699,8; 691,5
8,3
174e
8,47; 9,44r
699,2; 698,9
8,3
176a
1,43h
-
?
176b
1,25h
-
?
176c
-0,57h
-
?
176e
-0,40h
-
?
177
4,58c
734,1
8,4
178
11,01r
556,15
?
179
8,23m
718,4
8,8
180
3,60o
607,1
8,3
182e
2,80o
604,3
7,4
182f
3,44o
604,3
8,3
aWidma w pirydynie z rozprz aężeniem heterojądrowym. Wzorzec zewnętrzny: 2% H3PO4 w D2O. bDublet niesymetrycznych tryplet34 2 bów. cDublet dublet ców. dDublet. eDwa dublety tryplet d eów. fDwa cz fęściowo pokrywające się dublety trypletów. gCz gęściowo pokrywający się dublet trypletów. hNierozdzielony multiplet. iTryplet. jKwartet. kSekstet. lMultiplet. mDublet kwintet h i j k l mów. nDublet kwartet nów. oDublet tryplet oów. pWidmo w metanolu. rDublet nierozdzielonych multiplet p rów. sKwintet, widmo w chlorku metylenu. tSta s tłe sprzężeń nie wyznaczone ze względu na pokrywanie się sygnałów. uWidmo w wodzie. u

Menu2