Prace dyplomowe

Podsumowanie

Przedstawione w niniejszej rozprawie wyniki można podzielić na dwie części:

badania na związkach modelowych w roztworze,
funkcjonalizacja i znakowanie oligonukleotydów na podłożu stałym.

Reagenty i metody w badaniach na związkach modelowych dobrano tak, by później można było je stosować do funkcjonalizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Okazało się, że w większości przypadków wyniki tych badań mają bardziej ogólny charakter i poszerzają dotychczasową wiedzę na temat właściwości chemicznych H-fosfonianów, a także mogą być podstawą do rozwinięcia nowych kierunków badawczych tej klasy związków. Znalazło to wyraz w pracach opublikowanych w trakcie realizacji niniejszej rozprawy. W mojej ocenie najistotniejsze osiągnięcia tego etapu są następujące:

opracowanie metody syntezy H-fosfonianów aminoalkilo - nukleozydowych z wolną funkcją aminową na reszcie aminoalkilowej w bezpośredniej kondensacji H-fosfonianów nukleozydów z nieblokowanymi aminoalkoholami,¹³⁴
wyniki prac nad czynnikami wpływającymi na transestryfikację diestrów H-fosfonianowych, w tym alkilo- i arylo-H-fosfonianów nukleozydów,^137,138
w oparciu o transestryfikację fosforynu difenylowego - opracowanie nowych metod syntezy H-fosfonianów nukleozydów¹⁰² i wielu, jak dotąd trudno dostępnych, H-fosfonianów alkilowych,⁸⁹
opracowanie nowej metody syntezy fosforanotriestrów aminoalkilowych na drodze kondensacji oksydatywnej,¹⁴⁶
opracowanie nowej metody syntezy N-chronionych H-fosfonianów aminoalkilowych (syntonów nienukleotydowych),¹⁴⁵
stwierdzenie i dowiedzenie występowania reakcji amin pierwszorzędowych z akrylonitrylem w niektórych warunkach odblokowania oligonukleotydów.¹⁴⁷

Jednym z najważniejszych założeń proponowanych metod funkcjonalizacji oligomerów było ograniczenie lub wyeliminowanie stosowania grup blokujących w reagentach modyfikujących. Okazało się, że protonowanie funkcji aminowej aminoalkoholi na tyle skutecznie obniżało nukleofilowość atomu azotu, że nie obserwowano jego udziału w większości badanych reakcji substytucji nukleofilowej na centrum fosforowym. Ten prosty zabieg pozwolił na wykorzystanie nieblokowanych (a jedynie protonowanych) aminoalkoholi w następujących reakcjach:

chemoselektywna synteza aminoalkilo-H-fosfonianodiestrów wobec NEP-Cl jako czynnika kondensującego,
transestryfikacja H-fosfonianów arylowych z pełną chemoselektywnością w kierunku diestrów,
uniknięcie transestryfikacji internukleotydowych wiązań H-fosfonianodiestrowych podczas funkcjonalizacji oligonukleotydu otrzymanego metodą H-fosfonianową.
całkowicie chemoselektywna kondensacja oksydatywna H-fosfonianodiestrów do aminoalkilofosforotriestrów.

Wykorzystując wyniki otrzymane na związkach modelowych w roztworze, zgodnie z trzema planowanymi na początku wariantami (Schemat 16), opracowałem warunki funkcjonalizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Dodatkowo, opracowałem nowy wariant (Wariant Ib) funkcjonalizacji oligonukleotydów, w którym wykorzystałem aktywność fosfonianu difenylowego i jego produktów w reakcjach transestryfikacji. Tak więc, końcowym efektem badań nad funkcjonalizacją są cztery warianty przedstawione na Schemacie 45. Z wyjątkiem Wariantu II, opracowane podejścia można stosować do funkcjonalizacji oligonukleotydów otrzymanych zarówno metodą H-fosfonianową jak i amidofosforynową.

W trójetapowym Wariancie Ia, zastosowanie do fosfonylacji łatwego do otrzymania kwasu pirofosfonowego gwarantowało praktycznie ilościową fosfonylację oligonukleotydu. Kondensacja z chlorowodorkiem aminoalkoholu wobec NEP-Cl także zachodziła niemalże ilościowo i po utlenieniu jodem w warunkach standardowych otrzymywano sfunkcjonalizowany oligonukleotyd jako zdecydowanie główny produkt.

Wariant Ib to również modyfikacja stopniowa, w której do fosfonylacji stosowano odpowiedni nadmiar handlowego fosfonianu difenylowego. Powstający ilościowo w tej szybkiej reakcji, 5'-fenylo-H-fosfonian oligonukleotydu traktowany chlorowodorkiem aminoalkoholu, ulegał ilościowej transestryfikacji do 5'-aminoalilo-H-fosfonianu oligomeru. Po jego utlenieniu (I₂/H₂O) otrzymywano końcowy pożądany produkt - sfunkcjonalizowany oligonukleotyd, jako niemalże jedyny produkt trzech etapów modyfikacji.

W Wariancie Ib otrzymany na pierwszym etapie 5'-fenylo-H-fosfonian oligonukleotydu można wykorzystać do syntezy innych pochodnych np. zhydrolizować do 5'-H-fosfonianu oligomeru lub w reakcji z 2-cyjanoetanolem przekształcić w 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonian oligonukleotydu. Utlenienie i odblokowanie tego ostatniego prowadzi do 5'-fosforanów oligonukleotydów, z możliwością ich wykorzystania do katalizowanej enzymatycznie (T4 DNA ligaza) syntezy dłuższych fragmentów DNA, np. biologicznie funkcjonalnych jednostek genetycznych (promotory, geny struktury i wiele innych).

Ponadto, oprócz cech uniwersalności, Wariant Ib jest podejściem szczególnym, gdyż na żadnym etapie jego realizacji nie używa się czynników kondensujących, co może mieć decydujące znaczenie w przypadkach gdy modyfikacji poddaje się oligonukleotyd niosący ugrupowania podatne na acylowanie chlorkami acylowymi lub fosforylację chlorofosforanami.

Schemat 45

Funkcjonalizacja oligonukleotydów wg Wariantu II przebiegała zadowalająco jedynie na pierwszym etapie tj. generowania na końcu 5' oligomeru reszty 2-cyjanoetylo-H-fosfonianowej. Do otrzymywania 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligonukleotydów można było stosować dwie, równie wydajne metody, tj. transestryfikację 5'-fenylo-H-fosfonianuoligonukleotydu 2-cyjanoetanolem lub bezpośrednią kondensację 5'-HO-oligomeru z H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym wobec PivCl. Natomiast na etapie oksydatywnej kondensacji 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianu oligonukleotydu z chlorowodorkami aminoalkoholi, pożądany sfunkcjonalizowany oligonukleotyd otrzymywano z wydajnościami nie przekraczającymi 50%. Ponieważ analogiczne reakcje prowadzone na związkach modelowych w roztworze zachodziły ilościowo, sądzę, że niepowodzenia w tym przypadku związane są z układem heterogennym, w którym reagenty są w roztworze, a modyfikowany oligonukleotyd w fazie stałej. Niestety, nie miałem technicznych możliwości (³¹P NMR) śledzenia poszczególnych etapów modyfikacji centrum 5' fosforowego oligonukleotydu związanego z fazą stałą i z konieczności tę sprawę pozostawiłem nie do końca wyjaśnioną.

Jak można było się spodziewać, funkcjonalizacja oligonukleotydów wg Wariantu III, w którym oligomer fosfonylowano odpowiednio zablokowanym aminoalkilo-H-fosfonianem, zachodziła szybko i wydajnie. Ponieważ reakcje kondensacji i następnie utleniania prowadzi się w standardowych warunkach syntezy oligonukleotydów (metodą H-fosfonianową), to można cały proces funkcjonalizacji traktować jako dodatkowy cykl syntezy łańcucha oligonukleotydowego.

W niniejszej rozprawie opracowano trzy nowe, stosunkowo proste i jednocześnie efektywne metody funkcjonalizacji oligonukleotydów związanych z podłożem stałym. Wszystkie z nich spełniają stawiane w rozprawie kryteria metodyczne i ekonomiczne. Każda z prezentowanych w rozprawie metod funkcjonalizacji oligonukleotydów oparta jest na różnego typu reakcjach chemicznych i stosuje różne reagenty. Pozwala to na optymalny wybór jednej z nich w zależności od potrzeb i praktycznych możliwości realizacji.

Sfunkcjonalizowane oligonukleotydy znakowano różnymi grupami reporterowymi na podłożu stałym lub w roztworze, wykorzystując handlowo dostępne, aktywne pochodne fluoresceiny, rodaminy i biotyny. Przydatność otrzymanych nieradioizotopowych oligonukleotydowych sond molekularnychzostała sprawdzona z wynikiem pozytywnym w testach analitycznych wykonanych w niezależnych laboratoriach.

Na koniec, mając na uwadze uzyskane wyniki, pozwalam sobie wyrazić pogląd, że w mojej ocenie cele stawiane w niniejszej rozprawie zostały osiągnięte.