Włączanie grup reporterowych do sfunkcjonalizowanych oligomerów

We wstępnych eksperymentach, w których 5'-aminoalkio-oligonukleotyd VI traktowany był izotiocyjanianem fluoresceiny lub estrem 4-nitrofenylowym biotyny, znakowany oligomer XI uzyskiwany był ze stosunkowo niskimi wydajnościami (~20%, PAGE), niezależnie od stężenia reagentów i czasu reakcji.

Przypuszczałem, że niska wydajność powyższych reakcji związana jest ze strukturą jonu obojnaczego reszty aminoalkilo-fosforanowej. W tego typu zwitterjonie funkcja aminowa jest sprotonowana, co znacznie obniża jej reaktywność jako nukleofila. Założyłem, że dodanie silnej zasady np. DBU spowoduje przekształcenie struktury zwitterjonu w parę jonową: kation DBUH⁺ i anion fosforanowy, w którym funkcja aminowa reszty aminoalkilowej nie będzie protonowana. Dlatego też przed przyłączeniem grupy reporterowej przemywałem oligonukleotyd VI 0,2 M roztworem DBU w pirydynie, po czym poddałem go reakcji z izotiocyjanianem fluoresceiny (Schemat 44).

Zgodnie z oczekiwaniem, przyłączenie fluoresceiny było tym razem bardzo wydajne i oligomer XIa był głównym produktem oligonukleotydowym w surowej mieszaninie reakcyjnej (Zdjęcie 6). Szybko migrujące związki (poniżej barwnika XC, linie C i D) związane są prawdopodobnie z produktami przyłączenia izotiocyjanianu fluoresceiny bezpośrednio do podłoża CPG.

Analogiczne podejście zastosowałem w reakcji oligomeru VI z aktywnym estrem biotyny. W tym przypadku w trakcie reakcji kondensacji wydziela się 4-nitrofenol (pK_a 7,4), który ze względu na swój kwasowy charakter mógłby ponownie dezaktywować (protonować) funkcję aminową. By temu zapobiec, kondensacja prowadzona była w obecności DBU (0,05M). Podobnie jak w przypadku fluoresceiny, otrzymałem znaczącą poprawę wydajności syntezy znakowanego biotyną oligomeru XIb (Zdjęcie 7).
 

Przedstawiony protokół przyłączania grup reporterowych do sfunkcjonalizowanych oligonukleotydów na podłożu stałym wydaje się być podejściem bardziej ogólnym, umożliwiającym wprowadzanie również innych znaczników, np. izotiocyjanianu rodaminy, estru N-hydroksybursztynimidowego kwasu digoksygenino-3-O-metylokarbonylo-e-aminokapronowego i in.

W przypadku gdy charakter grupy reporterowej nie pozwala na przyłączenie jej na podłożu stałym, możliwe jest wyizolowanie sfunkcjonalizowanego oligonukleotydu i wykorzystanie go do przyłączenia znacznika w roztworze. Przydatność uzyskanych oligomerów w takim podejściu sprawdziłem w reakcji z izotiocyjanianem fluoresceiny i izotiocyjanianem rodaminy. Oligonukleotyd typu VI, 5'-aminopentylo-T₁₀ (Zdjęcie 8, linia A) został rozpuszczony w buforze boranowym pH 9,2 (100 ml), potraktowany roztworem odpowiedniego izotiocyjanianu (1 mg) w DMSO (30 ml) i pozostawiony na noc.¹⁰¹ Po wstępnym oczyszczeniu na kolumnie wypełnionej Sephadexem G-25 (NAP-10, Pharmacia-LKB), analiza na żelu poliakrylamidowym wykazała niemalże ilościowe przyłączenie znaczników fluorescencyjnych, prowadzące do oligomeru niosącego fluoresceinę (Zdjęcie 8, linia B) lub rodaminę (linia C).

Skuteczność opracowanych metod otrzymywania nieradioizotopowych sond molekularnych została potwierdzona syntezą znakowanych oligonukleotydów ukierunkowanych na wykrywanie specyficznych sekwencji nukleotydowych (Tabela 12). Sondy te zostały z powodzeniem wykorzystane w doświadczeniach biologicznych.

Przykładowy obraz na żelu poliakrylamidowym kolejnych etapów otrzymywania fluoresceinowej sondy HPV-16 przedstawiony jest na Zdjęciu 9. Oligomer ten (linia A) został zsyntetyzowany metodą H-fosfonianową, a funkcjonalizację przeprowadzono według Wariantu III - przyłączając do oligomeru H-fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-aminopentylowy (linia B). W ostatnim etapie do oligomeru przyłączona została fluoresceina (linie C i D). Sonda została odcięta od podłoża stałego i odblokowana wodnym stężonym roztworem amoniaku. Analogiczne wyniki uzyskane zostały dla pozostałych sond.