Badania nad funkcjonalizacją oligonukleotydów według Wariantu I

Funkcjonalizacja oligonukleotydów na podłożu stałym

Fosfonylacja

Kwas pirofosfonowy

Badając przebieg reakcji w czasie (Tabela 6), obserwowałem powstawanie nowego produktu oligonukleotydowego o mobilności elektroforetycznej spodziewanej dla 5'-fosfonylowanego oligomeru II. Po 120 min. substrat I (Zdjęcie 1, linia A^* ) ulegał praktycznie ilościowej fosfonylacji (Zdjęcie 1, linia B). Być może zastosowanie roztworu kwasu pirofosfonowego o wyższych stężeniach przyspieszyłoby reakcję fosfonylacji, jednakże próby przygotowania takiego roztworu zakończyły się niepowodzeniem, gdyż przy stężeniach wyższych niż 0,2 M sól pirydyniowa kwasu pirofosfonowego wytrącała się z roztworu.
 
 

Zdjęcie 1.

Chcąc uzyskać bardziej jednoznaczne potwierdzenie obecności reszty 5'-H-fosfonianowej w oligomerze II, po odcięciu z podłoża i odblokowaniu (wodny stężony roztwór NH₃) poddałem go działaniu alkalicznej fosfatazy. 5'-Fosfonylowany T₁₀ II nie ulegał defosfonylacji (PAGE), gdyż enzym nie rozpoznaje monoestrowej reszty H-fosfonianowej jako substratu.⁸⁷ Jeżeli 5'-fosfonylowany oligomer II w reakcji kondesacji z 2-cyjanoetanolem (wobec Piv-Cl) przekształcono w diester H-fosfonianowy, a po jego utlenieniu (I₂ w wodnej pirydynie) w fosforanodiester III, który po odblokowaniu (wodny stężony NH₃) do IV traktowano alkaliczną fosfatazą, to otrzymano ilościową defosforylację IV do nonafosforanu dekatymidynylowego V (Schemat 27). Powyższe wyniki można uznać za wystarczający dowód na to, iż reakcja fosfonylacji oligomeru I prowadzi do 5'-fosfonylowanego oligonukleotydu II.
 
 

I         II         III           IV           V

Tak więc, kwas pirofosfonowy może być z powodzeniem stosowany jako łagodny, monofunkcyjny czynnik fosfonylujący do wprowadzania reszt H-fosfonianowych na koniec 5' oligonukleotydów związanych z podłożem stałym.

Fosforyn difenylowy

Powstawanie dimerów można było zaobserwować podczas opisywanej wcześniej fosfonylacji 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyny w roztworze (str. *). Ilość tego typu produktu zmniejszała się wraz ze wzrostem nadmiaru fosforynu difenylowego użytego w reakcji. Można oczekiwać, że również w reakcjach na podłożu stałym, stosując odpowiednie nadmiary czynnika fosfonylującego, dimeryzacja będzie ograniczona lub wyeliminowana.
 
 

W pierwszej kolejności badałem możliwość powstawania dimerów T₁₀-O-P(O)H-O-T₁₀ w zależności od stosowanych nadmiarów fosfonianu difenylowego (Tabela 7). Oligomer I (Zdjęcie 2, linia A) poddałem działaniu roztworów fosforynu difenylowego w pirydynie o stężeniach 0,01, 0,05, 0,1 i 0,5M. Po 15 min. reakcji (czas wybrany arbitralnie), hydrolizie grupy fenoksylowej z powstałego 5'-fenylo-H-fosfonianu oligonukleotydu (Py-H₂O 9:1, 30 min.) i jego odblokowaniu (wodny stężony roztwór NH₃), produkty analizowano na żelu poliakrylamidowym. Pełna fosfonylacja następowała już przy użyciu 0,1M roztworu fosforynu, jednakże obok pożądanego H-fosfonianu oligonukleotydu obecne były znaczące (ok. 10%) ilości 5'-5' dimeru. Dopiero zastosowanie roztworu 0,5 molowego pozwoliło uzyskać H-fosfonian oligomeru (II) jako praktycznie jedyny produkt (Zdjęcie 2, linia B).

Zdjęcie 2.

W drugiej kolejności badałem czas konieczny do całkowitej fosfonylacji dla stężenia 0,5 M fosforynu difenylowgo, gdyż wybrany arbitralnie w pierwszym doświadczeniu czas piętnastu minut mógł okazać się niepotrzebnie zbyt długi. Stosując podobną metodę analizy (PAGE) mogłem ustalić, że przy powyższym nadmiarze fosforynu difenylowego, reakcja fosfonylacji oligomeru T₁₀ (I, Schemat 27) do 5'-H-fosfonianu oligonukleotydu II jest zakończona w czasie 5 minut (Tabela 8).

Tak więc, fosforyn difenylowy okazał się czynnikiem pozwalającym na wydajną fosfonylację oligonukleotydów w czasie znacznie krótszym, niż w przypadku analogicznej reakcji z użyciem kwasu pirofosfonowego. Ponadto, fosforyn difenylowy jest tanim, handlowym odczynnikiem i można go używać bez dodatkowych przygotowań.

Pragnę zwrócić uwagę, że w wyniku reakcji fosfonylacji oligonukleotydu fosforynem difenylowym otrzymuje się 5'-fenylo-H-fosfonian oligonukleotydu, który zawiera podatną na transestryfikację grupę fenylową. Jeżeli zamiast hydrolizy tego produktu, podda się go reakcji z aminoalkoholem, można spodziewać się powstawania 5'-aminoalkilo-H-fosfonianu oligonukleotydu, będącego docelowym produktem tego etapu modyfikacji oligomeru. Byłby to kolejny, bardzo prosty, wariant funkcjonalizacji oligonukleotydów.

Przyłączenie aminoalkoholu do 5'-H-fosfonylowancyh oligonukleotydów

Kondensacja 5'-H-fosfonianu oligonukleotydu z aminoalkoholami

II

VI

Jednakże po to, by zapewnić wysoką wydajność reakcji w układzie dwufazowym (roztwór/podłoże stałe), koniecznym jest stosowanie dużych nadmiarów (kilkadziesiąt, a nawet kilkaset ekwiwalentów molowych) reagentów. Stosowanie wolnego aminoalkoholu w tak dużym nadmiarze mogłoby powodować degradację otrzymanego metodą H-fosfonianową oligomeru (transestryfikacja internukleotydowych H-fosfonianodiestrów) lub powodować częściowe usuwanie ochronnych grup 2-cyjanoetylowych w oligonukleotydzie zsyntetyzowanym metodą amidofosforynową. Aby zapobiec tym niepożądanym reakcjom ubocznym, ponownie wykorzystałem protonowanie funkcji aminowej aminoalkoholu, które, jak będzie to później wykazane (przy reakcjach kondensacji oksydatywnej, str. *), znacznie osłabia nukleofilowość grupy -NH₂ aminoalkoholu. Jednocześnie funkcja hydroksylowa zachowuje charakter nukleofilowy i w planowanej reakcji grupa ta powinna być nukleofilem dominującym.

Zdjęcie 2.

Po utlenieniu i odblokowaniu roztworem amoniaku, pożądany 5'-aminoalkilo-oligonukleotyd został otrzymany z wydajnością prawie ilościową (Zdjęcie 3, linia C). Podobne wyniki uzyskane zostały dla aminoalkoholi 153e i f. Jeśli jednak do takiej samej funkcjonalizacji wykorzystany został oligomer I uzyskany metodą amidofosforynową to, po odblokowaniu amoniakiem, obok właściwego produktu pojawiły się znaczące ilości (40 - 80%) oligomeru o innej mobilności elektroforetycznej. Produkt ten nie był natomiast obserwowany, kiedy do końcowego odblokowania zastosowana została metyloamina¹²⁵(40% aq.) zamiast amoniaku. Problem tworzenia różnych produktów odblokowania 5'-aminoalkilofosforanów oligonukleotydów w zależności od metody ich syntezy omówię bardziej szczegółowo w dalszej części rozprawy.

1. Podsumowując, opisana powyżej metoda funkcjonalizacji oligonukleotydów wg Wariantu I realizowana jest w następujących etapach:
2. Fosfonylacja (dwa podejścia):
• z użyciem kwasu pirofosfonowego - 120 min.;
• z użyciem fosforynu difenylowego - 5 min. / hydroliza - 30 min.
3. Funkcjonalizacja: kondensacja z chlorowodorkiem aminoalkoholu wobec NEP-Cl - 4 min.
4. Utlenienie - 10 min.
5. Odblokowanie roztworem amoniaku lub metyloaminy.

Transestryfikacja 5'-fenylo-H-fosfonianu oligonukleotydu aminoalkoholami

I

VII

VI

Ze względów omówionych wcześniej, do transestryfikacji fenylowego H-fosfonianu oligonukleotydu VII stosowałem chlorowodorki aminoalkoholi. W pierwszej kolejności, stosując chlorowodorek aminopentanolu 153d (0,2M roztwór w pirydynie) badałem przebieg reakcji transestryfikacji VIIw czasie (Tabela 9). Po 60 minutach reakcja była zakończona, a jedynym nukleotydowym produktem obecnym w surowej mieszaninie po odcięciu z podłoża i odblokowaniu był sfunkcjonalizowany oligonukleotyd VI (PAGE).

Tak więc, w tym podejściu, nie stosując żadnych czynników kondensujących, a wykorzystując jedynie podatność arylowych H-fosfonianów na substytucję, można było w jednym ciągu reakcji przeprowadzić fosfonylację (I -> VII) i funkcjonalizację (VII -> VI) oligonukleotydu.

Podsumowując, do funkcjonalizacji oligonukleotydów powyższą metodą należy przeprowadzić następujące reakcje:

1. Fosfonylacja: fosforyn difenylowy - 5 min.
2. Funkcjonalizacja: transestryfikacja chlorowodorkiem aminoalkoholu - 60 min.
3. Utlenienie - 10 min.
4. Odblokowanie roztworem amoniaku lub metyloaminy.

Metoda ta będąca odmianą Wariantu I, angażująca wyjątkowo proste, dostępne handlowo reagenty pozwala na funkcjonalizację oligonukleotydów w sposób jeszcze prostszy i szybszy od zaproponowanego w poprzednim rozdziale niniejszej rozprawy.

Uważam, że obydwie opisane powyżej metody są równocenne i całkowicie spełniają początkowe wymogi funkcjonalizacji oligonukleotydów według Wariantu I. Fakt, że stosują one różnego typu substraty, a także różnego typu reakcje na poszczególnych etapach, może okazać się pomocny w przypadkach wykluczających stosowanie w trakcie funkcjonalizacji któregoś z reagentów (np. chlorofosforanów jako czynników kondensujących lub H-fosfonianu difenylowego wobec silnych zasad). Tak więc, w mojej ocenie, należy traktować powyższe metody jako uzupełniające, a nie alternatywne.

Modyfikacje aminoalkilo-oligonukleotydów podczas odblokowania

Schemat 30

Dla potwierdzenia tych założeń, otrzymany metodą H-fosfonianową i oczyszczony (PAGE) 5'-aminoalkilo-T₁₀ traktowano wodnym roztworem amoniaku wobec nadmiaru akrylonitrylu (10 ekw.). Po 2 godz. reakcji 5'-aminoalkilo oligonukleotyd przekształcał się ilościowo w produkt o identycznej mobilności (PAGE), jak produkt uboczny, który powstawał w trakcie odblokowania oligomerów syntetyzowanych metodą amidofosforynową. Ten wynik silnie sugeruje, że wolna funkcja aminowa grupy 5'-aminoalkilowej sfunkcjonalizowanego oligomeru ulega N-alkilowaniu akrylonitrylem do analogu N-(2-cyjanoetylo)aminoalkilowego. Jeśli tak jest rzeczywiście, to zablokowanie funkcji aminowej grupą ochronną powinno całkowicie zapobiegać N-alkilowaniu. I faktycznie, oligomer z grupą 5'-[N-(4,4'-dimetoksytrytylo)]-aminoalkilową, traktowany takim samym roztworem amoniaku wobec nadmiaru akrylonitrylu, pozostał niezmieniony w ciągu 16 godzin.

Można przyjąć następne założenie, że zastosowanie do końcowego odblokowania oligomeru aminy (np. metyloaminy) w miejsce amoniaku powinno także zabezpieczyć przed N-alkilowaniem reszty aminoalkilowej, gdyż powstający akrylonitryl będzie wyłapywany przez znajdującą się w dużym nadmiarze aminę. Także i wtym przypadku założenia zweryfikowano w doświadczeniu, w którym oczyszczony 5'-aminoalkilo-oligonukleotyd pozostał niezmieniony podczas szesnastogodzinnego działania akrylonitrylu (10 ekw.) w wodnym 40% roztworze metyloaminy.

Aby uzyskać bezpośrednie dowody możliwości zachodzenia reakcji alkilowania grup aminowych, przeprowadziłem badania na związkach modelowych: fosforanie nukleozydowo - aminoalkilowym 146 i aminoalkilonukleozydzie 148⁹⁹ (Schemat 31).

Oba te związki traktowane akrylonitrylem (10 ekw.) w roztworze amoniaku, w ciągu 15 min. przekształcały się ilościowo w nowe produkty (TLC). Po izolacji, ustalono ich strukturę (¹H i ³¹P NMR) jako analogi N-(2-cyjanoetylo)aminoalkilowe 147 i 149. W podobnych doświadczeniach z zastosowaniem metyloaminy wmiejsce amoniaku, oba związki (146 i 148) pozostały niezmienione w ciągu 24h.

Podsumowując, podczas otrzymywania sfunkcjonalizowanych oligomerów otrzymanych metodą amidofosforynową, zawierających wolne reszty aminoalkilowe, należy mieć na uwadze możliwość alkilacji tych reszt akrylonitrylem, uwolnionym w trakcie końcowego odblokowania amoniakiem. Reakcja ta nie zachodzi gdy:

• oligomer otrzymano metodą H-fosfonianową,
• grupa aminowa jest zablokowana podczas traktowania amoniakiem,
• odblokowanie przeprowadza się w roztworze metyloaminy zamiast amoniaku.