Prace dyplomowe

Modyfikacje w pozycjach 1', 2' i 4' szkieletu cukrowego

Idea modyfikacji reszty cukrowej (C-1', C-4' i 2'-OH) oparta jest na założeniu, że reszta ta nie jest bezpośrednio uwikłana w proces hybrydyzacji, w związku z czym jej modyfikacje nie powinny w istotny sposób wpływać na trwałość dupleksu. Wybór takiego sposobu modyfikacji z reguły wymaga przygotowania w pierwszej kolejności odpowiednio zmodyfikowanego nukleozydu, następnie jego amidofosforynu lub H-fosfonianu i wprowadzenie go do oligomeru. Syntony tego typu można wprowadzać w dowolnej pozycji łańcucha oligonukleotydowego. Możliwe jest też wprowadzanie do oligomeru wielu tego typu jednostek.

Modyfikacje pozycji 1'

Amidofosforyn nukleozydu zmodyfikowanego w pozycji 1' (85)⁸⁸ otrzymany został w wieloetapowej syntezie (Schemat 11), w której substratem był 2,3'-O-anhydro-1-(1,4,6-tri-O-benzoilo-b-d-fruktofuranozylo)uracyl. Po hydrolizie mostka tlenowego 2,3' grupa 2'-OH usunięta została działaniem N,N'-tiokarbonyloimidazolu i wodorkiem tributylocyny wobec 2,2'-azobis(izobutyronitrylu). Benzoilowe grupy ochronne tak otrzymanej 3'-deoksypsikourydyny usunięto następnie roztworem NaOH. Reszty -OH w pozycjach 4' i 6' zablokowano dwufunkcyjną grupą 1,1,3,3-tetraizopropylodisiloksan-1,3-diylową (TIPDS), a w pozycji 1'-OH przyłączono diaminę za pośrednictwem N,N'-karbonylodiimidazolu. Wolną resztę -NH₂ zablokowano grupą 9-fluorenylometoksykarbonylową (Fmoc), a resztę siloksanową usunięto z pozycji 3'-O i 5'-O działaniem fluorku tetrabutyloamoniowego. Ostatecznie w grupę 5'-hydroksylową zablokowano dimetoksytrytylem i przeprowadzono fosfitylację w pozycji 3'-O, co doprowadziło do syntonu 85. Włączany był on do oligonukleotydów wg standardowych procedur, a po odblokowaniu i oczyszczeniu oligomeru reszta 1'-aminoalkilowa wykorzystana była do przyłączenia pirenu i antrachinonu.

Schemat 11

W innym podejściu⁶¹, stosując amidofosforyn typu 86, wprowadzono w wybrane pozycje łańcucha oligonukleotydowego jednostki 3'-deoksypsikotymidynylowe z pozycją 1'-hydroksylową zabezpieczoną resztą lewulinylową.

Po zakończeniu syntezy oligomeru grupę lewulinylową usunięto selektywnie octanem hydrazyny i do uwolnionej reszty 1'-OH przyłączono amidofosforyn typu 57 (*) niosący resztę glikolanu trifluoroetylowego lub chloroetylowego jako miejsce dalszej modyfikacji.

57 Tego typu ugrupowanie karboksyestrowe pod wpływem diaminy przekształca się łatwo w ugrupowanie aminoalkilokarbamidowe (związek typu 87). Po usunięciu wszystkich grup blokujących, w reakcji z chlorkiem 4-(dimetyloamino)azobenzeno-4'-sulfurylu, do reszty aminoalkilowej w pozycji 1' przyłączono grupę dabsylową jako znacznik nieradioizotopowy sondy.

Modyfikacje pozycji 4'

Modelowanie komputerowe wykazało, że przyłączenie łańcucha alkilowego do węgla 4' ma znacznie mniejszy wpływ na stabilność dupleksu DNA-DNA niż podobne modyfikacje w innych pozycjach reszty cukrowej. Weryfikację eksperymentalną obliczeń i wyników komputerowych zrealizowano przez syntezę oligomeru, w którym w wybranych pozycjach ulokowano odpowiednio modyfikowane jednostki nukleotydowe⁸⁹. W tym celu przed syntezą oligonukleotydu konieczne było przygotowanie odpowiednio modyfikowanego amidofosforynu 88. Substratem do syntezy tego ostatniego był unikalny nukleozyd (4'- hydroksy-2'-deoksyurydyna), który w siedmiu etapach syntetycznych przekształcono w 4'-aminoalkilo-2'-deoksyurydunę i, po zablokowaniu funkcji 5'-OH, w amidofosforyn 88.

Przeprowadzono syntezy szeregu oligomerów z modyfikacjami w różnych pozycjach sekwencji. Do odsłoniętych w trakcie końcowego odblokowania grup aminoalkilowych przyłączano biotynę, otrzymując zestaw sond molekularnych modyfikowanych w jednej lub kilku pozycjach. Porównawcze pomiary efektywności hybrydyzacji wykazały, że każdy 4'-modyfikowany nukleotyd obniżał T_m jedynie o 1,2 - 1,7°C, co potwierdziło eksperymentalnie wcześniejsze wyniki otrzymane z modelowania komputerowego.

Modyfikacje pozycji 2'-OH

W odróżnieniu od modyfikacji w pozycjach 1' i 4', które wymagały syntezy nienaturalnych jednostek nukleozydowych jako substratów, do modyfikacji w pozycji 2' wykorzystano naturalne rybonukleozydy, a reakcje funkcjonalizacji ukierunkowano na alkilowanie grupy 2'-hydroksylowej. Przykładem takiego podejścia może być alkilowanie bromkiem S-trytyloalkilowym odpowiednio przygotowanego nukleozydu z wolną grupą 2'-OH⁹⁰. Po fosforynacji otrzymywano amidofosforyn modyfikowanego nukleozydu 89, który włączano do oligonukleotydu.

Ze względu na obecność objętościowej grupy trytylowej w sąsiedztwie centrum fosforowego, po to, by zapewnić dostatecznie wysoką wydajność przyłączenia tak modyfikowanego syntonu do łańcucha oligonukleotydowego, konieczne było wydłużenie czasu kondensacji z 1 min. do 10 min. Próby zastąpienia grupy trytylowej mniej objętościowymi grupami tert-butylową czy 2-cyjanoetylową zakończyły się niepowodzeniem.
W podobny sposób otrzymano analogicznie zmodyfikowany amidofosforyn nukleozydu 90⁹¹. Zastosowanie dłuższego łącznika n-heksylenowego w miejsce etylenowego nie zmieniło zasadniczo efektywności kondensacji i także w tym przypadku konieczne było wydłużenie czasu kondensacji do 10 min.

W obu podejściach należało stosować na etapie utleniania wodoronadtlenek tert-butylowy w miejsce standardowo używanego I₂/H₂O, gdyż w obecności jodu grupa trytylotioeterowa była nietrwała. Z oligomeru, po syntezie usuwano grupę trytylową (AgNO₃), a do wygenerowanej reszty -SH przyłączano piren, fluoresceinę czy fenantrolinę jako grupy reporterowe.

Ponieważ alkilowanie nukleozydów wiąże się z niebezpieczeństwem modyfikacji reszt zasadowych, T. H. Keller i R. Haner zaproponowali przeprowadzenie reakcji alkilowania odpowiednio blokowanej rybozy [3,5-O-(1,1,3,3-tetraizopropylodisiloksan-1,3-diylo)-b-d-rybofuranozydu metylowego] i dopiero tak modyfikowany cukier wykorzystywano w reakcji glikozylacji tyminy lub adeniny⁹². Uzyskany rybozyd tyminy posłużył do syntezy pochodnej cytydynowej, nie przedstawiono natomiast metody otrzymywania modyfikowanej w ten sposób guanozyny. Dimetoksytrytylowanie i fosforynowanie tak otrzymanych nukleozydów prowadziło do amidofosforynów typu 91a - c, niosących w pozycji 2'-O różne grupy modyfikujące⁹³.

Otrzymane oligonukleotydy pozwoliły porównać wpływ charakteru reszty modyfikującej na trwałość dupleksu DNA-DNA. I tak, grupy lipofilowe w pozycji 2'-O (np. n-oktyl) powodowały destabilizację dupleksu (obniżenie T_m), natomiast grupy hydrofilowe (kation n-alkiloamoniowy) czy interkalujące (antrachinon) wywierały efekty stabilizujące dupleks. Wprawdzie prace te nie opisywały syntezy sond molekularnych z nieradioizotopowymi grupami reporterowymi, jednak uważam, że mieszczą się w tematyce niniejszego przeglądu.

Podsumowanie

Opisane powyżej metody modyfikacji pozycji 1', 4' i 2'-OH pozwalają na wprowadzanie różnych ugrupowań w dowolne miejsce oligonukleotydu. Modyfikacje te nie powodują zwykle znaczącego pogorszenia właściwości hybrydyzacyjnych oligomerów, a nawet mogą je polepszyć. Umożliwiają przeprowadzanie różnorodnych badań oddziaływań DNA - DNA i DNA - białko. Pomimo faktu, że molekularne sondy oligonukleotydowe opisane w tym rozdziale mają pewne zalety w porównaniu z sondami o innym typie modyfikacji, to zalety te nie są aż tak dominujące, by polecać modyfikacje w pozycjach 1', 4' czy 2'-O jako zdecydowanie najlepsze. Dodatkowo, ze względu na stopień trudności i złożoność przygotowania tego typu sond, ich zastosowania będą ograniczone jedynie do specjalnych celów lub przypadków, gdy inne typy modyfikacji nie będą możliwe.