Prace dyplomowe

Modyfikacje 5'-końca oligonukleotydu

Modyfikacje 5'-końca przeprowadza się po zakończeniu syntezy łańcucha oligonukleotydowego. Podejście to ma szereg zalet i otwiera wiele dodatkowych możliwości syntetycznych, do których należą:

stosowanie standardowych podłoży stałych, bez konieczności ich dodatkowego przygotowywania;
możliwość wprowadzania grup reporterowych bez konieczności ich chronienia na wszystkich etapach syntezy oligomeru;
możliwość różnorodnych modyfikacji na tych samych próbkach oligomeru, co jest szczególnie istotne przy weryfikacji efektywności metod otrzymywania sond;
funkcjonalizację i przyłączanie grupy reporterowej dokonuje się na oligomerach związanych z podłożem, co zdecydowanie ułatwia izolację finalnego produktu.

Syntezę oligonukleotydowych sond molekularnych niosących nieradioizotopowe grupy reporterowe na końcu 5' można realizować etapami (funkcjonalizacja i przyłączenie grupy reporterowej) lub też przez przyłączenie na ostatnim etapie syntezy oligomeru modyfikowanego syntonu nukleotydowego lub nienukleotydowego.

Etapowa modyfikacja oligonukleotydu

Podejście to polega na modyfikowaniu oligonukleotydu na podłożu stałym poprzez przyłączanie kolejnych fragmentów sondy, prowadząc ostatecznie do uzyskania oligomeru z grupą funkcyjną lub reporterową na końcu 5'.
W jednej z pierwszych opisanych metod do funkcjonalizacji oligonukleotydu wybrano grupę fosforanową⁴⁵. Przyłączony do podłoża oligomer 34 traktowano p-chlorofenylofosforoditriazolidem, otrzymując po hydrolizie produkt 35 z grupą p-chlorofenylofosforanową. Następnie w typowej reakcji kondensacji z 2-(biotynyloamido)etanolem wobec 1-(2-mezytylenosulfonylo)-3-nitro-1,2,4-triazolu otrzymano sondę 36 z przyłączoną biotyną, którą odblokowano i izolowano wg wcześniej opisanych metod (Schemat 4).Wybór reszty fosforanowej jako łącznika wydaje się być szczególnie trafny, gdyż stanowi ona naturalne "wydłużenie" oligomeru i reszta ta nie powinna powodować zaburzeń procesu hybrydyzacji.

Schemat 4

Wg podobnej koncepcji do fosforylacji oligomeru wykorzystano aktywne pochodne fosforu trójwartościowego: PCl₃ lub salicylochlorofosfinę (Schemat 5)⁴⁶. W obu przypadkach po pierwszym etapie, tj. po przyłączeniu fosforynu do oligomeru, aktywne centrum fosforowe poddawano hydrolizie do H-fosfonianu, który w kolejnej reakcji z N-1-trifluoroacetyloetanoloaminą wobec chlorku piwaloilu ulegał estryfikacji. Po utlenieniu i odblokowaniu otrzymywano oligonukleotyd z grupą aminoalkilową przyłączoną poprzez resztę fosforanową na końcu 5'.

Schemat 5

Analogiczny produkt otrzymano w podobnym cyklu reakcji (Schemat 6), jednakże łącznik aminoalkilowy wprowadzano na etapie oksydatywnej kondensacji 5'-(metoksy-H-fosfonianu) oligomeru z diaminoetanem⁴⁶.

Schemat 6 W ostatnich trzech przypadkach zastrzeżenia mogą budzić wielofunkcyjne, bardzo reaktywne czynniki fosfitylujące, które mogą modyfikować zasady azotowe, a także prowadzić do powstawania produktów dimeryzacji.

Odmiennym typem reagentów generujących aktywny układ na końcu 5' są karbodiazolidy^47-49. Aktywacja oligonukleotydu 34 karbonylodiimidazolem prowadzi do pochodnej typu 44, nieaktywnej wobec alkoholi, natomiast łatwo reagującej z aminami⁵⁰. W wyniku reakcji z 1,6-diaminoheksanem uzyskano karbaminian typu 45. Po przyłączeniu biotyny i odblokowaniu roztworem amoniaku (reszta karbaminianowa jest trwała w tych warunkach⁴⁹) otrzymano gotową sondę oligonukleotydową (Schemat 7).

Schemat 7

Podobnie przebiegły reakcje prowadzące do 5'-SH oligomeru⁴⁷ (Schemat 8). W tym przypadku pochodną karbonyloimidazolową typu 44 potraktowano S-dimetoksytrytylocysteiną. Produktem tej reakcji był oligomer 47 z dowiązaną na końcu 5' cysteiną (poprzez ugrupowanie karbaminianowe). Resztę tiolową cysteiny wykorzystano po odblokowaniu do dowiązania grupy pirenylowej. Oprócz grupy -SH oligomer 48 niesie na końcu 5' również grupę karboksylową, potencjalne miejsce selektywnego przyłączania innego typu grupy reporterowej.

Schemat 8

Również podobny system funkcjonalizacji zastosowano do otrzymania sondy oligonukleotydowej znakowanej wieloma grupami reporterowymi⁴⁸. Na pierwszym etapie sprzęgano 1,6-diaminoheksan z oligomerem wobec karbonylodiimidazolu. Stosując następnie dwukrotną kondensację z Na -Ne -di-Fmoc-lizyną wobec BOP przyłączono do grupy -NH₂ cztery reszty lizyny. Ochronne grupy Fmoc usuwane były selektywnie działaniem DBU, a do uwolnionych w ostatnim etapie grup aminowych przyłączane były cząsteczki biotyny, prowadząc do związku typu 49. Po odcięciu od podłoża i odblokowaniu w standardowych warunkach izolowano tetrabiotynylowaną sondę oligonukleotydową techniką HPLC lub PAGE.

Modyfikowane syntony nukleotydowe

W podejściu tym otrzymane na podłożu stałym oligomery poddaje się dodatkowej kondensacji z syntonami, w których w miejsce standardowych nukleozydów wprowadzono nukleozydy ze zmodyfikowaną pozycją 5'. Ponieważ związki te przyłącza się w ostatnim etapie syntezy, uzyskiwane oligonukleotydy niosą modyfikację na końcu 5'. Struktura omawianych syntonów, bardzo zbliżonych do typowych syntonów nukleozydowych, pozwala na wykorzystanie do ich przyłączania standardowych procedur wydłużania łańcucha oligonukleotydowego.

Dla realizacji takiego podejścia zaproponowano użycie związków typu 50 jako końcowej modyfikowanej jednostki nukleotydowej^51,52. Labilne w warunkach zasadowych grupy chroniące resztę aminową usuwane były w trakcie końcowego odblokowania roztworem amoniaku. Po syntezie oligomeru, kondensacji z amidofosforynem typu 50 i odblokowaniu, reszta aminowa w pozycji 5' uwolnionego oligomeru wykorzystana była do wprowadzania fluorescencyjnych grup reporterowych.

W celu uzyskania oligonukleotydów z grupą -SH na końcu 5' zaproponowano analogiczne do opisanych powyżej syntony typu 51⁵³. Lipofilowa grupa trytylowa na końcu 5' oligonukleotydów otrzymanych z wykorzystaniem z tego typu syntonów umożliwiała łatwe oczyszczanie produktu za pomocą RP-HPLC^*. Grupę trytylową usuwano jonami srebra lub rtęci.

Przedstawione powyżej metody wydają się mało atrakcyjne z dwóch powodów: (i) konieczność syntezy modyfikowanych nukleozydów i ich amidofosforynów; (ii) bezpośrednie przyłączenie grupy funkcyjnej do węgla 5' reszty cukrowej może powodować powstawanie znacznej zawady przestrzennej po przyłączeniu grupy reporterowej, co może mieć negatywny wpływ na proces hybrydyzacji i detekcji.

Syntony nienukleotydowe

Syntony nienukleotydowe są to analogi syntonów nukleotydowych, w których w miejsce szkieletu nukleozydowego zastosowany jest najczęściej szkielet węglowy z jedną lub wieloma odpowiednio chronionymi grupami funkcyjnymi. System protekcji tych grup jest tak dobrany, by był on kompatybilny z powszechnie stosowanymi, rutynowymi metodami syntezy oligonukleotydów. Tak przygotowany synton nienukleotydowy może być przyłączany do oligomeru w standardowym cyklu syntetycznym, co nie wymaga zmiany reagentów lub też zmiany oprogramowania syntetyzera. Syntony nienukleotydowe można podzielić zasadniczo na dwa typy. Typ pierwszy to syntony funkcjonalizujące oligomer (Tabela 3), do którego w dodatkowym cyklu syntetycznym przyłączana jest grupa reporterowa. Drugi typ syntonu zawiera już związaną grupę reporterową (Tabela 4) i jego kondensacja z oligomerem prowadzi w jednym etapie do gotowego produktu - sondy oligonukleotydowej z przyłączoną grupą reporterową.

Ze względu na znaczą liczbę opisanych metod syntezy i zastosowań syntonów nienukleotydowych zestawiono je w tabelach i opatrzono komentarzem podkreślającym istotne właściwości chemiczne i ich konsekwencje.

Tabela 3. Amidofosforyny wprowadzające grupy funkcyjne

Nr	Związek	Komentarz	Lit.
52		Synton wprowadza resztę tiolową chronioną grupą trytylową. Otrzymano analogiczne H-fosfoniany⁵⁴. Grupa trytylowa pozwala na łatwe oczyszczenie oligomeru za pomocą RP-HPLC^*. Odblokowanie reszty tiolowej roztworem azotanu srebra w dodatkowej reakcji.	54, 55
53		Synton wprowadza resztę tiolową chronioną grupą 2,4-dinitrofenyloetylową, labilną w warunkach zasadowych. Odblokowanie reszty tiolowej: NH_{3 aq. stęż.}/0,1 M DTT	56
54		Synton wprowadza resztę aminową chronioną grupą trifluoroacetylową, labilną w warunkach zasadowych. Odblokowanie reszty aminowej następuje w trakcie końcowego działania roztworem amoniaku.	57
55		Syntony wprowadzają resztę aminową chronioną pochodnymi grupy trytylowej, labilnymi w warunkach kwaśnych. Analogicznie otrzymano H-fosfoniany⁵⁴. Lipofilowe pochodne grupy trytylowej pozwalały na łatwe oczyszczenie oligomeru na RP-HPLC* i były usuwane następnie 80% kwasem octowym⁵⁸ lub służyły do kolorymetrycznego śledzenia wydajności funkcjonalizacji oligomeru⁵⁹. Odblokowanie reszty aminowej przed odcięciem od podłoża pozwala na przyłączenie grupy reporterowej do oligomeru na podłożu stałym.	54, 58, 59
56		Synton wprowadza resztę aminową chronioną grupą Fmoc, labilną w warunkach zasadowych. Wykorzystanie: do funkcjonalizacji metylofosfonianów oligonukleotydów. Odblokowanie w temp. pok.: a) NH_{3 aq. stęż.}/2 h, b) EDA - EtOH/6h.	60
57		Synton wprowadza grupę estrową, pozwalającą na uzyskiwanie różnych grup funkcyjnych w zależności od warunków odblokowania. Ostateczna funkcjonalizacja oligomeru z przyłączonym związkiem 57 następuje przed odblokowaniem NH_{3 aq. stęż.}, podobnie, jak to opisano dla modyfikacji końca 3' (Tabela 2).	61
58		Związki typu 58 - 60 służą do uzyskiwania rozgałęzionych oligonukleotydów (typu "drzewo") umożliwiających wprowadzanie wielu grup reporterowych.	62
59			63
60			19
61		Synton wprowadza resztę aminową, chronioną labilną w warunkach zasadowych grupą trifluoroacetylową oraz resztę hydroksylową, chronioną grupą dimetoksytrytylową. Pozwala to na wielokrotne przyłączenie amidofosforynów 61 i uzyskiwanie rozgałęzionych oligonukleotydów (typu "grzebień"), umożliwiających wprowadzanie wielu grup reporterowych. Odblokowanie reszt aminowych następuje w trakcie działania roztworem amoniaku.	19
62		Synton wprowadza resztę aminową, chronioną labilną w warunkach zasadowych grupą trifluoroacetylową oraz resztę hydroksylową, chronioną grupą dimetoksytrytylową. Pozwala to na wielokrotne przyłączenie amidofosforynów 62 i uzyskiwanie rozgałęzionych oligonukleotydów (typu "grzebień"), umożliwiających wprowadzanie wielu grup reporterowych. Odblokowanie reszt aminowych następuje w trakcie działania roztworem amoniaku. W reakcji biotynylacji oligomeru zawierającego 5 jednostek typu 62 otrzymano sondę, która była wykrywalna w ilości 0,5 ng.	64
63		Synton wprowadza resztę hydroksylową chronioną grupą dimetoksytrytylową, co pozwala na wielokrotne przyłączenie amidofosforynów 63. Związek ten ("spacer") służy do zwiększania odległości między grupami aktywnymi w oligomerach typu "grzebień". Ma to na celu oddalenie od siebie grup reporterowych aby ograniczyć ich wzajemne oddziaływania.	19

Spośród syntonów funkcjonalizujących chciałbym wyróżnić amidofosforyn typu 55. Zawiera on względnie prosty szkielet węglowy (co ułatwia jego przygotowanie) i po przyłączeniu do oligomeru umożliwia kolorymetryczny pomiar wydajności funkcjonalizacji. Dodatkowo chemoselektywne usunięcie protekcji grupy funkcyjnej pozwala na przyłączenie grupy reporterowej do oligomeru związanego z podłożem, co znacznie upraszcza procedurę izolacji finalnego produktu syntezy. Alternatywnie, odblokowanie oligomeru z zachowaniem lipofilowej blokady dimetoksytrytylowej stwarza możliwość szczególnie skutecznego oczyszczenia sfunkcjonalizowanego oligonukleotydu za pomocą RP-HPLC.

Tabela 4. Amidofosforyny wprowadzające grupy reporterowe

Nr	Związek	Komentarz	Lit.
64		Synton wprowadza resztę biotynylową. Nierozpuszczalny w CH₃CN. Do modyfikacji oligomerów konieczne jest stosowanie roztworu DMF/CH₂Cl₂.	65, 66
65		Synton wprowadza resztę biotynylową niosącą w pozycji 1-N grupę dimetoksytrytylową, zwiększającą rozpuszczalność amidofosforynu 65 w CH₃CN. Ponadto pozwala ona na kolorymetryczne ocenienie wydajności modyfikacji lub na wydajne oczyszczenie produktu za pomocą RP-HPLC lub OPC* .	67, 68
66		Synton wprowadza cząsteczkę fluoresceiny w postaci estru metylowego. W warunkach końcowego odblokowania amoniakiem następuje odtworzenie grupy karboksylowej. Otrzymano również analogiczny H-fosfonian.	69
67		Synton wprowadza cząsteczkę fluoresceiny chronioną grupami piwaloilowymi. Odblokowanie grup funkcyjnych fluoresceiny następuje w trakcie końcowego działania amoniakiem.	70
68		Synton wprowadza cząsteczkę fluoresceiny chronioną grupami piwaloilowymi. Grupa dimetoksytrytylowa umożliwia kolorymetryczne monitorowanie wydajności przyłączenia syntonu do oligomeru. Grupa dimetoksytrytylowa w pobliżu centrum fosforowego stanowi zawadę przestrzenną i pomimo wydłużenia czasu kondensacji do 120 sek. wydajność przyłączenia syntonu była umiarkowana (70%). Odblokowanie grup funkcyjnych fluoresceiny następuje w trakcie końcowego działania amoniakiem.	41
69		Synton wprowadza cząsteczkę 2-metoksy-6-chloro-9-aminoakrydyny. Końcowe odblokowanie należy przeprowadzać 0,5M roztworem NaOH w H₂O/EtOH aby uniknąć pękania akrydynowego wiązania C9 - NH.	28, 71
70		Synton wprowadza cząsteczkę akrydyny. Opracowano również procedurę otrzymywania analogicznego H-fosfonianu. Odblokowanie oligomeru znakowanego za pomocą syntonu 70 można przeprowadzać w standardowych warunkach	72
71		Synton wprowadza cząsteczkę pirenu (fluorofor).	63, 73
72		Synton wprowadza cząsteczkę ryboflawiny (fluorofor).	74
73		Synton wprowadza kompleks rutenu z trzema cząsteczkami batofenantroliny. Kompleks ten jest trwały chemicznie i wykazuje silną fluorescencję o długim czasie trwania. Pozwala to uniknąć krótkotrwałej fluorescencji tła, dzięki czemu uzyskuje się czułość porównywalną z metodami radioizotopowymi (time resolved fluorescence). Amidofosforyn 73 otrzymywano in situ ze względu na trudności w izolacji czystego związku.	75
74		Synton wprowadza biotynę oraz chronioną grupą dimetoksytrytylową resztę hydroksylową, która pozwala na przyłączenie kolejnych amidofosforynów typu 74. Umożliwia to uzyskiwanie oligonukleotydów z przyłączonymi wieloma grupami reporterowymi. Nie opisano praktycznego wykorzystania związku 74 do modyfikacji oligomeru.	76
75		Synton wprowadza biotynę lub fosfotyrozynę (hapten) oraz chronioną grupą dimetoksytrytylową resztę hydroksylową, która pozwala na przyłączenie kolejnych amidofosforynów typu 75. Umożliwia to uzyskiwanie oligonukleotydów z przyłączonymi wieloma grupami reporterowymi. Nie należy usuwać ostatniej grupy dimetoksytrytylowej przed odblokowaniem amoniakiem, gdyż wolna grupa hydroksylowa reszty gliceryny atakuje w tych warunkach sąsiednie ugrupowanie fosforanowe powodując utratę grup reporterowych. Oligomer zawierający 8 cząsteczek biotyny był wykrywalny w ilości 0,1 ng, a zawierający 8 cząsteczek fosfotyrozyny w ilości 1 ng.	77
76		Synton wprowadza hapten (2,4-dinitrofenyl) oraz chronioną grupą dimetoksytrytylową resztę hydroksylową, która pozwala na przyłączenie kolejnych amidofosforynów typu 76. Umożliwia to uzyskiwanie oligonukleotydów z przyłączonymi wieloma grupami reporterowymi. Nie należy usuwać ostatniej grupy dimetoksytrytylowej przed odblokowaniem amoniakiem, gdyż wolna grupa hydroksylowa reszty gliceryny atakuje w tych warunkach sąsiednie ugrupowanie fosforanowe powodując utratę grup reporterowych. Natomiast modyfikowane oligomery z zachowaną ostatnią grupą dimetoksytrytylową były trwałe w warunkach odblokowania (co jest sprzeczne z wcześniejszymi doniesieniami o nietrwałości grupy DNP w roztworze amoniaku⁷⁸). Najwyższą czułość, 14 pg uzyskano dla oligomeru z trzema cząsteczkami dinitrofenolu. Rodzaj łącznika miał mały wpływ na poziom detekcji oligomeru.	79

Wykorzystanie syntonów 64 - 76 wydaje się być najprostszą metodą wprowadzania grup reporterowych w pozycji 5' oligonukleotydów. Należy jednak zwrócić uwagę, że często synteza tego typu związków jest procesem wieloetapowym, a produkt końcowy uzyskiwany jest z niską wydajnością. Ograniczone jest też spektrum możliwych do wykorzystania grup reporterowych, gdyż muszą one być odporne na warunki kondensacji, utleniania i odblokowania oligomeru. Ponadto wprowadzenie innego znacznika do oligonukleotydu wiąże się z koniecznością syntezy nowego syntonu. W związku z tymi niedogodnościami uważam, że korzystniejszym podejściem jest funkcjonalizacja oligomeru, a następnie przyłączenie grupy reporterowej.

Fosforylacja 5'-końca oligonukleotydu

Fosforylacja 5' - końca oligonukleotydu nie jest reakcją modyfikacji, gdyż wprowadzenie reszty fosforanowej w tę pozycję jest wydłużeniem naturalnego szkieletu oligomeru. Jednakże, 5' - końcowa grupa fosforynowa czy fosforanowa może być dogodnym substratem do dalszychmodyfikacji. Dlatego też ująłem w tej części mojej pracy reakcje fosforylacji jako istotny fragment potencjalnej metody funkcjonalizacji końca 5' - oligonukleotydów.

77	`R₁ = Me, CE, Npe` `R₂ = CE, Npe`

Jednymi z pierwszych reagentów zastosowanych z powodzeniem do fosforylacji oligonukleotydu związanego z podłożem stałym były N,N-diizopropyloamidofosforyny dialkilowe typu 77⁸⁰. Produktem reakcji fosforynacji był 5'-dialkilofosforyn oligonukleotydu, utleniany następnie do fosforanu. Grupy alkilowe usuwano działaniem: tiofenolanu (R=Me), amoniaku (R=CE) lub DBU (R=Npe), uzyskując 5'-fosforylowany oligomer.

Przykładem innego czynnika fosforylującego, który prowadził do analogicznego 5'-fosforylowanego oligonukleotydu jest N,N-diizopropyloamidofosforyn 2-cyjanoetylowo - 2-[2'-(4,4'-dimetoksytrytyloksy)etylosulfonylo]etylowy (78)⁸¹. Obok "aktywnego" ugrupowania amidofosforynowego i ochronnej grupy 2-cyjanoetylowej zastosowano ugrupowanie 2-(2'-hydroksyetylosulfonylo)etylowe. To ostatnie zawierało grupę dimetoksytrytylową, co umożliwiało monitorowanie (test barwny) reakcji fosforynacji. Obydwie grupy fosforanoalkilowe [2-cyjanoetylową i 2-(2'-hydroksyetylosulfonylo)etylową] usuwano w reakcji b -eliminacji w środowisku zasadowym.

W innym podejściu, do fosforylacji oligomeru zastosowano N,N-diizopropyloamidofosforyn 2-cyjanoetylowo - 2-(trifenylosililo)etylowy (79)⁸². Po utlenieniu i odblokowaniu roztworem amoniaku, grupa 2-(trifenylosililo)etylowa wciąż pozostawała związana z resztą 5'-fosforanową. Dzięki temu możliwe było łatwe oczyszczenie (za pomocą RP-HPLC) pożądanego produktu od zanieczyszczeń nie niosących tego silnie lipofilowego ugrupowania. Grupę 2-(trifenylosililo)etylową usuwano następnie jonami fluorkowymi, uzyskując 5'-fosforan oligonukleotydu.

Kolejnym amidofosforynem stosowanym do fosforylacji oligonukleotydów jest związek 80⁸³. Otrzymano go z 2,2-bis(hydroksymetylo)malonianu dietylowego poprzez dimetoksytrytylowanie i fosfitylację. Zastosowanie tego amidofosforynu umożliwia dwutorowe wykorzystanie właściwości grupy dimetoksytrytylowej: kontrolowanie wydajności reakcji fosforylacji dzięki uwalnianiu barwnego kationu dimetoksytrytylowego (metoda "trityl off") lub wydajne oczyszczanie oligomeru dzięki lipofilowym właściwościom tej grupy (metoda "trityl on"). To drugie podejście jest możliwe dzięki nieoczekiwanej trwałości estru 2,2-bis(etoksykarbonylo)-3-(4,4'-dimetoksytrytyloksy)propylowego w stężonym roztworze amoniaku. Natomiast po usunięciu grupy dimetoksytrytylowej, ugrupowanie to staje się nietrwałe w warunkach zasadowych i traktowanie oligomeru wodnym roztworem amoniaku lub aminy pozwala na uzyskanie 5'-fosforanu oligonukleotydu (Schemat 9).

Schemat 9

Opisane powyżej podejścia z wykorzystaniem amidofosforynów prowadziły do 5'-fosforanów oligonukleotydów. Lepsze możliwości przyłączania innych reagentów modyfikujących czy grup reporterowych na końcu 5' wydaje się stwarzać ugrupowanie wodorofosforynowe. Może być też ono traktowane jako modyfikacja oligomerów służąca np. do badań aktywności substratowej w reakcjach enzymatycznych.

Najprostsze reagenty służące do otrzymania 5'-wodorofosforynów oligonukleotydów to opisane wcześniej (*) PCl₃ i salicylochlorofosfina⁴⁶. Ze względu na dużą reaktywność stwarzają one jednak zagrożenie modyfikacji zasad azotowych łańcucha oligonukleotydowego.

Bardziej odpowiednia dla selektywnego modyfikowania 5'-końcowej reszty hydroksylowej oligonukleotydów jest metoda z użyciem monoestrów H-fosfonianowych 81⁸⁴ lub 82⁸⁵, zawierających podatne na b -eliminację reszty alkilowe.


81	82

Związek 81 [H-fosfonian 2-(p-nitrofenylo)etylowy] otrzymano przeprowadzając PCl₃ w tris(1,2,4-triazoilo)fosforyn, który poddawano reakcji z 2-(p-nitrofenylo)etanolem. Po hydrolizie powstałego p-nitrofenylofosforoditriazolidu, produkt 81 oczyszczano na żelu krzemionkowym. H-Fosfonian 2-cyjanoetylowy 82 otrzymano przez hydrolizę dichlorofosforynu 2-cyjanoetylowego i stosowano bez oczyszczania. Związki powyższe umożliwiają fosfonylację oligonukleotydów w reakcji standardowej kondensacji z chlorkiem piwaloilu. b-Eliminacja reszty 2-(p-nitrofenylo)etylowej następuje w wyniku działania DBU, reszta 2-cyjanoetylowa zaś ulega b -eliminacji w trakcie końcowego działania amoniakiem. W obu przypadkach uzyskuje się 5'-wodorofosforyny oligonukleotydów.

W powyższych podejściach zastrzeżenia może budzić brak zadowalającej procedury uzyskiwania czystych monoestrów. Opisana została jednak inna, prosta metoda otrzymywania wodorofosforynów monoalkilowych poprzez transestryfikację H-fosfonianu difenylowego odpowiednim alkoholem. Powstający na pierwszym etapie H-fosfonian dialkilowy hydrolizuje się do monoestru, który wydziela się jako produkt krystaliczny⁸⁶.

Marsters i wsp.⁸⁷ opublikowali metodę bezpośredniej fosfonylacji oligonukleotydu kwasem fosforawym z użyciem chlorku piwaloilu jako czynnika aktywującego. Przy proponowanym sposobie aktywacji kwasu fosforawego i stosowanych nadmiarach reagentów produktem głównym (~90%) reakcji był symetryczny H-fosfonian 5'-5' dioligonukleotydowy (83). Zwiększenie ilości kwasu fosforawego względem chlorku piwaloilu w roztworze fosfonylującym poprawiło wydajność 5'-H-fosfonianu oligonukleotydu (84), jednakże 5'-5' symetryczny dimer był nadal jednym z głównych (~40 %) produktów reakcji (Schemat 10). Przy dalszym wzroście nadmiaru H₃PO₃ fosfonylacja zachodziła ze zdecydowanie mniejszą wydajnością.

W zamierzeniach autorów metody, jej głównym walorem miało być stosowanie prostych i tanich reagentów, a także prostej chemii prowadzącej bezpośrednio do pożądanego produktu. Otrzymane wyniki negatywnie zweryfikowały te oczekiwania. Według mojej oceny podejście to nadal zasługuje na uwagę, jednakże wymaga dopracowania metodycznego. Uważam, że warunkiem koniecznym kontroli procesu fosfonylacji w proponowanym systemie jest identyfikacja czynnika fosfonylującego. Bez większego ryzyka można postulować, że układ produktów opisany przez Mastersa i wsp. wiąże się nie z samą reakcją fosfonylacji, lecz ze sposobem aktywacji kwasu fosforawego chlorkiem piwaloilu i kontrola tej ostatniej reakcji może znacznie poprawić chemoselektywność procesu.

Schemat 10