Prace dyplomowe

Modyfikacje internukleotydowych grup fosforanowych

Aktualnie stosowane metody syntezy oligonukleotydów oparte są o chemię fosforu trójwartościowego (amidofosforyny lub wodorofosforyny). W obu stosowanych metodach powstałe w reakcji kondensacji triestry fosforynowe lub diestry H-fosfonianowe należy utlenić do fosforanów. Konieczność utlenienia internukleotydowego wiązania w trakcie lub też po zakończeniu syntezy oligomeru otwiera możliwości modyfikacji centrum fosforowego. Reakcje utleniania triestrów i diestrów kwasu fosforawego zachodzą według innych mechanizmów, co zostało wykorzystane do wprowadzania punktowych modyfikacji reszty fosforanowej ukierunkowanych na syntezę oligonukleotydowych sond molekularnych niosących nieradioizotopowe grupy reporterowe.

Modyfikacje prowadzące do amidofosforanów

Ten typ modyfikacji można stosować w przypadku, gdy w oligomerze występuje diestrowe wiązanie H-fosfonianowe. W podejściu tym wykorzystano fakt, że utlenianie diestrów wodorofosforynów halogenoalkanami (CCl₄) lub jodem prowadzi w pierwszej kolejności do halogenofosforanów, które w reakcjach z nukleofilami można przekształcać w pochodne fosforanów. Tak więc, w reakcjach utleniania wobec nadmiaru wody finalnymi produktami są diestry fosforanowe. Jeżeli w analogicznej reakcji nukleofilem jest amina, finalnymi produktami utlenienia są amidofosforany (Schemat 12), które mogą być wykorzystane do przyłączenia grup reporterowych.

Schemat 12

Powyższe właściwości wodorofosforynów wykorzystano w syntezie modyfikowanych oligonukleotydów¹¹¹, gdzie do nukleozydu związanego z podłożem stałym przyłączano następną jednostkę nukleozydową z wytworzeniem diestrowego wiązania H-fosfonianowego (Schemat 13). Utlenianie (I₂) otrzymanego diestru H-fosfonianowego wobec nieblokowanego 1,7-diaminoheptanu prowadziło do amidofosforanu N-(7-aminoheptylowego). Do wolnej grupy aminowej przyłączano aktywny ester biotyny, wprowadzając w ten sposób grupę reporterową i uzyskując jednocześnie trwałe ugrupowanie podczas dalszej elongacji łańcucha oligonukleotydowego. Po uwolnieniu z podłoża i odblokowaniu oligomeru otrzymano gotową sondę z przyłączoną na końcu 3' biotyną jako grupą reporterową (Schemat 13).

Schemat 13

Innym wariantem podobnej modyfikacji może być podejście, w którym jako nukleofil zastosowano N-trifluoroacetyloalkilodiaminę^112-114 (Schemat 14).

Schemat 14

W wyniku oksydatywnej amidacji otrzymywano prekursor sondy oligonukleotydowej z ugrupowaniem amidofosforowym, w którym funkcja aminowa reszty aminoalkilowej chroniona była trwałą podczas syntezy oligomeru grupą trifluoroacetylową. W trakcie odblokowania (NH_{3 aq. stęż.}) odsłaniano także tę funkcję i dopiero po izolacji sfunkcjonalizowanego oligomeru przyłączano grupę reporterową.

Analogicznie otrzymano oligomer typu 108 z przyłączoną w różnych pozycjach łańcucha pochodną wiologenu (bis-czwartorzędową solą 4,4'-dipirydylu, będącą potencjalnym źródłem wolnych rodników) z odsłoniętą resztą aminową, która nie była chroniona podczas syntezy łańcucha oligonukleotydowego¹¹⁵.

108

Autorzy metody nie dyskutowali wpływu wolnej grupy aminowej w łańcuchu bocznym na efektywność dalszej syntezy oligonukleotydu.

Dalszym przykładem modyfikacji centrum fosforowego diestrów H-fosfonianowych jest oksydatywna kondensacja z N-trifenyloacetylocystaminą 109¹¹⁶, która prowadziła do oligomeru niosącego lipofilową grupę trytylową ułatwiającą jego oczyszczanie (HPLC - faza odwrócona). Po oczyszczeniu oligomer poddawano działaniu DTT, pod wpływem którego pękał mostek disiarczkowy i uwalniała się funkcja -SH, co umożliwiało przyłączanie grup reporterowych np. w reakcjach alkilowania.

109

Modyfikacje prowadzące do tiofosforanów

Innym sposobem funkcjonalizacji reszty fosforanowej jest przeprowadzenie jej w pochodną tiofosforanową. Tego typu związki, podobnie jak tiole, podatne są na reakcje alkilowania, co pozwala na wprowadzenie do oligomeru grupy reporterowej.

Przykładem takiego podejścia jest szereg reakcji przedstawiony na Schemacie 15. Oligomer związany z podłożem fosforynowano za pomocą trichlorku fosforu lub salicylochlorofosfiny (2-chloro-5,6-benzo-1,3,2-dioksafosforin-4-onu). Resztę H-fosfonianową ternalizowano trimetylochlorosilanem i następnie utleniano siarką elementarną. Powstający tiofosforan alkilowano 1-tlenkiem 2-decylo-2,3,5,5-tetrametylo-4-(3-jodo-2-oksopropylidieno)imidazolu. Tak otrzymany oligomer odblokowano roztworem amoniaku i wykorzystywano w badaniach elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR)⁴⁶.

Schemat 15

Innym podejściem pozwalającym na otrzymanie oligonukleotydów zawierających wiązanie tiofosforanowe jest prowadzenie syntezy oligonukleotydu metodą amidofosforynową, a jedynie ostatnią kondensację metodą H-fosfonianową. Ugrupowanie wodorofosforynowe utleniano następnie siarką, uzyskując na końcu 5' oligomeru diestrową resztę tiofosforanową. Oligonukleotyd odblokowywano roztworem amoniaku i w reakcji alkilowania wprowadzano takie grupy reporterowe jak biman, dansyl lub fluoresceinę¹¹³.

Kombinacja modyfikacji poprzez amidofosforany i tiofosforany

Różnice w reaktywności funkcji aminowej i tiofosforanowej pozwalają na wprowadzenie do oligomeru dwóch różnych grup reporterowych¹¹³. W tym celu w trakcie syntezy oligonukleotydu metodą amidofosforynową dwukrotnie zastosowano syntony wodorofosforynowe. Pierwszy H-fosfonian wprowadzono na początku syntezy (koniec 3') i utleniono czterochlorkiem węgla wobec 1-N-trifluoroacetylo-1,6-diaminoheksanu. Drugi synton H-fosfonianowy użyto na zakończenie syntezy oligomeru (koniec 5') i wiązanie H-fosfonianowe utleniono siarką. Tak modyfikowany oligomer odblokowano w standardowy sposób po czym resztę tiofosforanową na końcu 5' alkilowano selektywnie monobromobimanem {3,6,7-trimetylo-4-bromometylo-1,5-diazabicyklo[3.3.0]okta-3,6-dien-2,8-dionem}(znacznik fluorescencyjny). Funkcję aminową łańcucha aminoalkilowego na końcu 3' wykorzystano do przyłączenia biotyny (w postaci estru aktywnego) lub fluoresceiny (w postaci izotiocyjanianu, uzyskując sondę oligonukleotydową typu 110. Stosowanie oligomerów z przyłączonymi w określonych pozycjach łańcucha dwiema różnymi grupami reporterowymi powinno uprościć prowadzenie takich badań jak np. analiza strukturalna DNA, oddziaływania DNA - białko czy dynamika kwasów nukleinowych.

110

Inne metody modyfikacji

Pisząc o modyfikacjach internukleotydowych reszt fosforanowych prowadzących do oligomerów z nieradioizotopowymi grupami reporterowymi, warto wspomnieć, że modyfikacje mogą być wykorzystane do innych celów, np. w badaniach rentgenograficznych. Przykładem może być praca Dalla Riva Tomy i Bergstroma¹¹⁷, którzy wprowadzili atom wolframu do wiązania internukleotydowego w reakcji triestru fosforynowego z pentakarbonylo(h²-cis-cyklookteno)wolframem(0).

111

Dinukleotydy typu 111 otrzymano w roztworze, jak i na podłożu stałym, jednak wydajności reakcji były bardzo niskie (16 - 25%). Próby zastosowania powyższego podejścia do modyfikacji oligonukleotydów zakończyły się niepowodzeniem.

Podsumowanie

Modyfikacje wiązania internukleotydowego dają możliwości otrzymywania oligonukleotydów znakowanych nieradioizotopowo w różnych (również wielu) pozycjach i z różnymi łącznikami. Metody te są atrakcyjne także dlatego, że można je łatwo modyfikować, podobnie jak w etapowym modyfikowaniu końca 5'. Wady tego podejścia to powstawanie diastereoizomerów oraz konieczność zachowania bezwodnych warunków podczas utleniania.