Prace dyplomowe

Wstęp

Naturalną formą wzajemnych oddziaływań kwasów nukleinowych jest tzw. hybrydyzacja, czyli tworzenie struktur dwu lub więcej niciowych, będących wynikiem parowania zasad purynowych i pirymidynowych (T lub U z A, C z G). Proces ten zachodzi z bardzo wysoką specyficznością. To ostatnie wykorzystano do wykrywania w mieszaninach DNA lub RNA określonych sekwencji przy pomocy tzw. oligonukleotydowych sond molekularnych. Oligonukleotydowe sondy molekularne są to oligomery o zdefiniowanych (najczęściej programowanych) sekwencjach, które są komplementarne do sekwencji adresowanej (poszukiwanej). W odpowiednio dobranych warunkach sonda hybrydyzuje jedynie z sekwencją komplementarną, pomimo obecności w badanym materiale wielu (często kilku lub kilkudziesięciu milionów) fragmentów o wysokiej homologii do sekwencji poszukiwanej. W eksperymentach kompetycyjnych, w których stosowano dwie krótkie sondy syntetyczne, z czego jedna była dokładnie komplementarna do sekwencji adresowanej, a druga miała zmienioną tylko jedną jednostkę nukleotydową, ta pierwsza tworzyła dupleks ze stukrotnie większą wydajnością niż druga.¹

Niezwykle wysoką specyficzność procesu hybrydyzacji wykorzystano w diagnostyce genetycznej do wykrywania nawet pojedynczych mutacji w badanym materiale (najczęściej genomowy DNA lub pula komórkowego RNA). Najprostszy protokół hybrydyzacyjny realizowany jest w czterech etapach:

immobilizacja badanego materiału,
hybrydyzacja z sondą molekularną,
odmycie nadmiaru reagentów,
detekcja sondy.

Analiza prowadzona wg tego protokołu nie zawsze daje dostatecznie jednoznaczne wyniki ze względu na tzw. sygnały tła. Wprowadzono więc szereg wariantowych podejść analitycznych, których celem było podwyższenie specyficzności oddziaływań sondy lub systemu sond z badanym DNA lub RNA^2-4. Typowe przykłady takich metod to tzw. hybrydyzacja "warstwowa" ("kanapkowa" - sandwich hybridisation) lub jej odmiana - hybrydyzacja "prętowa" (dipstick hybridisation) oraz hybrydyzacja "z wymianą nici" (strand displacement hybridisation). W dwóch pierwszych przypadkach stosuje się układ dwóch sond oligonukleotydowych, z których jedna, immobilizowana, wychwytuje fragmenty DNA lub RNA zawierające poszukiwaną sekwencję, a drugi oligomer, sonda detekcyjna, służy do wizualizacji utworzonego hybrydu. W metodzie "z wymianą nici" immobilizowany układ sondy wychwytującej i tylko częściowo do niej komplementarnej sondy detekcyjnej (chodzi o celowe utworzenie możliwie nietrwałego dupleksu) traktuje się mieszaniną kwasów nukleinowych. Jeżeli w analizowanym materiale obecne są sekwencje dokładnie komplementarne do sondy wychwytującej, to te fragmenty DNA (lub RNA) wypierają sondę detekcyjną z pierwotnego kompleksu. Porównanie ilości sondy detekcyjnej wciąż związanej z podłożem z tą, jaka jest w roztworze, pozwala na stwierdzenie obecności i ilościowe oszacowanie zawartości poszukiwanej sekwencji w badanym materiale.

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów) lub sondy syntetyczne (zwykle o długości 10 - 50 nukleotydów). Zalety sond syntetycznych to:^2,5

stosunkowo łatwa dostępność,
możliwość dowolnego programowania sekwencji sondy,
nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,
krótki czas hybrydyzacji (minuty),
wysoka selektywność.

Oligonukleotydy pochodzenia naturalnego lub otrzymane na drodze chemicznej syntezy wtedy i tylko wtedy mogą być sondami molekularnymi, kiedy można je wykrywać. Sprawa ta jest niezwykle istotna ze względu na fakt, iż ilości analizowanego materiału są zazwyczaj niewielkie. Popularnie stosowane bezpośrednie metody wykrywania kwasów nukleinowych, takie jak absorpcja UV lub wybarwianie, są dalece niewystarczające do wykrycia nawet nanomolowych ilości dupleksu sonda-analizowany DNA lub RNA. Po to, by zwiększyć czułość detekcji, zaopatruje się sondy molekularne w różnego typu znaczniki (atomy, grupy reporterowe), które można wizualizować nawet przy bardzo małych stężeniach (np. attomolowych). Dotychczas najpowszechniej stosowanymi znacznikami sond molekularnych są radioizotopy wprowadzane do szkieletu oligonukleotydu w miejsce ich niepromieniotwórczych, naturalnych odpowiedników. Znaczniki radioizotopowe mają tę zaletę, że pozwalają wykrywać stosunkowo niewielkie ilości (rzędu 10^-18 mola) sondy i nie zmieniają jej struktury chemicznej. Jednakże przygotowanie i stosowanie sond znaczonych radioizotopami wiąże się z poważnymi niedogodnościami i niebezpieczeństwami takimi jak:

konieczność zorganizowania laboratorium radioizotopowego,
konieczność odpowiedniego wyszkolenia personelu,
niebezpieczeństwo radioaktywnego skażenia otoczenia,
problem odpadów promieniotwórczych,
ograniczony czas życia izotopów radioaktywnych (np. t_1/2 dla ³²P wynosi 14,3 dnia),
drogie odczynniki znakowane izotopami promieniotwórczymi,
możliwość radiolizy badanego materiału,
konieczność wielokrotnego znakowania sondy przy długich seriach badań,
utrudnione pomiary ilościowe.

Powyższe niedogodności sprawiły, że od kilkunastu lat trwają prace nad alternatywnymi metodami syntezy i detekcji sond molekularnych. Działania te są dodatkowo stymulowane potrzebami laboratoriów klinicznych, oczekujących systemów prostych, możliwie tanich i bezpiecznych. Prace te koncentrują się nad opracowaniem nowych metod przygotowania sond niosących znaczniki nieradioizotopowe, które można wykrywać przez rejestrację fluorescencji, luminescencji lub barwnej reakcji enzymatycznej.^2,6-9 Pomimo znacznej intensyfikacji badań w ostatnich latach, nie opracowano uniwersalnego podejścia, które zyskałoby powszechną akceptację. Wciąż poszukuje się prostszych, skuteczniejszych i tańszych systemów wprowadzania grup reporterowych do oligonukleotydów.

Projektując nową metodę nieradioizotopowego znakowania oligonukleotydu należy wziąć pod uwagę następujące kryteria:

tanie i łatwo dostępne reagenty,
łatwość i szybkość modyfikacji oligonukleotydu,
możliwość automatyzacji procesu modyfikacji,
trwałość sondy w warunkach hybrydyzacji,
wykrywalność sondy po hybrydyzacji,
trwałość sondy podczas przechowywania,
łatwość modyfikacji metody,
koszty.

Tabela 1

Typ grupy reporterowej	Znacznik	Wykrywalność sondy (x 10^-18 mola)	Metoda detekcji
Radioizotop	³²P, ³⁵S, ¹²⁵I	0,05 - 6^*	Autoradiografia, zliczanie scyntylacyjne
Enzym	Peroksydaza, alkaliczna fosfataza	0,1 - 10	Kolorymetria, fluorymetria, luminometria
Fluorofor	Fluoresceina, rodamina, akrydyna	1 - 100	Fluorymetria
Chelatowany jon metalu ziem rzadkich	Europ, terb	1 - 100	Fluorymetria szybka

Jednym z podstawowych kryteriów decydujących o przydatności sondy znakowanej nieradioizotopowo jest poziom jej detekcji, który powinien być przynajmniej porównywalny z poziomem detekcji sondy radioizotopowej (Tabela 1^6,10). Taką wykrywalność uzyskano już dla technik opartych na reakcjach enzymatycznych.^11-19 Pomimo że w prostych i tanich metodach opartych na bezpośrednim pomiarze fluorescencji, uzyskiwany sygnał jest słabszy niż dla metod radioizotopowych czy enzymatycznych, możliwe jest jednak uzyskanie równie wysokiego poziomu wykrywania sond fluorescencyjnych poprzez zastosowanie odpowiednich czytników lub poprzez zwiększenie ilości badanego kwasu nukleinowego za pomocą technik amplifikacyjnych in vitro, z których najpowszechniejszą jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR).^20,21

Grupy reporterowe przyłączane są do oligomerów najczęściej za pomocą odpowiedniego łącznika (linkera). Jest nim zwykle łańcuch polimetylenowy zakończony grupą aktywną chemicznie (np. -NH₂, -SH), wykorzystywaną do wiązania grupy reporterowej. Wiązanie to musi być trwałe w warunkach izolacji i dalszego stosowania sondy. W niektórych metodach przyłączanie grup reporterowych można przeprowadzać w środowisku wodnym, co stosuje się podczas modyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych po usunięciu grup ochronnych.

Grupy reporterowe typu alkilującego - imidy kwasu maleinowego i halogenoacetamidy - przyłącza się do reszty tiolowej łącznika, wykorzystując podatność atomu siarki na alkilację. Inną cechą reszty tiolowej, wykorzystywaną do przyłączania grup reporterowych (np. białek), jest łatwe wytwarzanie wiązań disiarczkowych w reakcji z drugą grupą tiolową (Rys. 1).

Rys. 1. Reakcje pochodnych grup reporterowych z oligonukleotydem funkcjonalizowanym grupą tiolową

Do znakowania oligonukleotydów zmodyfikowanych ugrupowaniami z wolnymi funkcjami aminowymi (Rys. 2²²) stosuje się grupy reporterowe z ugrupowaniami acylującymi (np. izotiocyjaniany czy estry p-nitrofenylowe).

W wyniku reakcji pochodnych grup reporterowych z centrum nukleofilowym łącznika powstaje wiązanie tioeterowe (dla reszty -SH) lub karbamidowe czy tiomocznikowe (dla reszty -NH₂). Tego typu połączenia są trwałe w warunkach izolowania, oczyszczania i aplikacji sond molekularnych.

Rys. 2. Reakcje pochodnych grup reporterowych z oligonukleotydem funkcjonalizowanym grupą aminową

Jako miejsca modyfikacji proponuje się praktycznie wszystkie elementy struktury łańcucha oligonukleotydowego: zasady azotowe (puryny i pirymidyny), szkielet cukrowy oraz resztę fosforanową (Rys. 3). W dalszych częściach rozdziału omówione zostaną poszczególne podejścia i ich konsekwencje.

Rys. 3. Miejsca funkcjonalizacji oligonukleotydów